基于CRISPR/Cas9系統構建大鼠Kcnk2敲除載體的研究

艾慧婷，劉欣煜，雷維瓊，陳恒玲

(1.中南民族大學 生物醫學工程學院 醫學信息分析及腫瘤診療湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430074；2.武漢市第四中學，湖北 武漢 430034)

1 引言

雙孔鉀離子通道(K2P)是近年來發現的一類新型的鉀通道成員，共有17個成員組成。Kcnk2(potassium two pore domain channel subfamily K member 2,又稱TREK1,Gene ID:170899)即編碼雙孔鉀離子通道(K2P)中重要成員TREK1(TWIK related mechano-gated K+ channel)的基因，而TREK1是一種弱內向整流雙孔鉀通道(tandem-pore-domain weakly inward rectifying potassium channel,TWIK)相關的機械性門控雙孔鉀離子通道。

以往的研究表明，TREK1與抑郁癥有著密切的關聯，很可能成為抗抑郁治療的靶點。有研究發現，SSRI類抗抑郁藥物處理后的Kcnk2+/+小鼠相比于對照組Kcnk2+/+小鼠的靜止時間明顯縮短，而抑郁劑SSRI對Kcnk2-/-小鼠無效[1]。Kennard等[2]利用全細胞膜片鉗技術發現，抗抑郁藥氟西汀可以抑制TREK1電流的產生且洗脫后電流強度恢復，也進一步驗證了TREK1很可能是SSRI類抗抑郁藥物的作用靶點。此外，越來越多的研究表明K2P通道與傷害感受性疼痛有關。TREK1和TRPV1共定位在DRG神經元中，TREK1敲除可以抑制炎癥誘導的機械痛和熱痛的痛覺過敏[3]。TRESK敲除后可以增強DRG神經元的興奮性[4]。事實上，TREK1更多的生理功能在越來越多的研究中被證實，所以對TREK1進行基因編輯，是一種重要的研究手段。

近年來，CRISPR/Cas9基因編輯技術(圖1)以其低成本、易操作、打靶成功率高等優點備受研究者們的青睞[5]。本文使用的pL-CRISPR.EFS.GFP質粒(圖2)是以CRISPR/Cas9系統為原理，通過對BsmBⅠ位點進行酶切，插入人工設計的gRNA序列，重組轉化獲得慢病毒。

圖1 CRISPR/Cas9工作原理

圖2 pL-CRISPR.EFS.GFP質粒圖譜

2 實驗部分

2.1 實驗材料

Kcnk2 oligo序列(武漢tsingke公司合成)；質粒提取試劑盒(OMEGA D6950-01，美國)；BSMBⅠ酶(Thermo，美國)；Annealing buffer(淼靈，中國)；T4 ligation(TAKARA，日本)；DNA凝膠回收試劑盒(OMEGA D6950-01，美國)；Stbl3感受態細胞(實驗室制備)。

2.2 實驗方法

實驗通過導入編碼guide RNA和Cas 9的質粒重新剪切整合，從而實現對目的基因的雙鏈DNA的切割。通過退火來制備sgRNA雙鏈，用BsmbⅠ酶進行質粒酶切，構建pL-CRISPR.EFS.GFP重組質粒、進行轉化和菌落PCR檢驗并使用通用測序引物U6測序，然后抽提質粒，病毒包裝獲得慢病毒。

2.2.1 質粒提取

按照OMEGA質粒提取試劑盒說明書進行提取。

2.2.2 基因敲除靶點及寡核苷酸設計

使用CRISPR設計工具 (https://www.synthego.com/)得到guide RNA，由guide RNA序列設計互補的DNA oligo，本實驗選取了Kcnk2互補引物序列見表1，oligo示意圖及NGG位點如圖3所示。

表1 Kcnk2基因互補的oligo序列

圖3 oligo序列示意

2.2.3 酶切與回收

根據抽提的pL-CRISPR.EFS.GFP質粒濃度，按照表2的酶切反應體系，將所有試劑混合均勻，在37 ℃下反應2 h。將酶切完成的質?；旌袭a物，進行凝膠電泳，用DNA凝膠回收試劑盒進行酶切產物回收，測量濃度待用。

表2 酶切反應體系

2.2.4 退火

將公司合成好的Kcnk2引物(oligo1，oligo2)，按照以下退火體系進行退火實驗(表3)。將退火后產物用水以1∶200進行稀釋后備用。

表3 退火反應體系

a設定溫度梯度，每分鐘降低2 ℃，使退火溫度從95 ℃降至25 ℃

2.2.5 連接

將退火稀釋后的oligo，與酶切回收后的pL-CRISPR.EFS.GFP，按照以下連接體系進行反應，4 ℃過夜連接或者16 ℃連接2 h(表4)。

表4 連接反應體系

2.2.6 Stbl3感受態細胞制備(Inoue 法)

本實驗中采用Inoue法制備Stbl3感受態細胞。該方法中使用的Inoue buffer中各成分，可增加細胞膜的通透性，更容易吸收外源DNA，表5為使用的Inoue buffer配方。此外，該法采用16 ℃低溫培養使得細菌轉化效率大大提高。

表5 Inoue buffer緩沖溶液配方

2.2.7 轉化

(1)在100 μL的Stbl3感受態細胞中加入3 μL連接好的產物，輕柔混合均勻后，于冰上靜置30 min。

(2)準備42 ℃恒溫水浴鍋、37 ℃恒溫搖床，預熱37 ℃ 500 μL的LB液體培養基(不含氨芐抗生素)以及LB固體培養基。

(3)將冰上靜置好的混合物放入42 ℃水浴鍋內熱擊90 s，平穩迅速地拿出，立即放在冰上冷卻3 min，然后于超凈臺中將預熱的LB液體培養基滴加入混合液。

(4)將混合液放入37 ℃，200 r/min恒溫搖床中培養60 min，此步是使細胞狀態復蘇，恢復抗性。

(5)將搖床復蘇后的細胞混合液5000 g，離心5 min，棄去大部分上清，留下約100 μL的培養基重新懸浮細胞，然后用玻璃棒將細胞懸液均勻涂布在LB平板上，靜置數分鐘后，待液體完全被吸收，倒置平板，在37 ℃細菌培養箱中過夜培養。

2.2.8 重組克隆的鑒定與測序

采用Touchdown PCR方法進行菌落鑒定，挑選陽性克隆，委托武漢擎科公司進行測序。Touchdown PCR的兩條引物為來自載體的引物Test primer F，該序列為5-CATTCGATTAGTGAACGGATC-3，和來自目的基因Kcnk2的oligo 2，按照表6加入各組分，并按照表7 Touchdown PCR反應條件進行PCR擴增：

表6 Touchdown PCR工作體系

表7 Touchdown PCR反應條件

b 2-4重復進行，共30個循環，每4個循環降低2 ℃，將溫度從68 ℃降至52 ℃

3 結果與分析

3.1 質粒提取和質粒酶切的結果

pL-CRISPR.EFS.GFP提取濃度為320 ng/μL, A260∶A280為1.940，達到實驗要求。按照表2酶切反應體系進行酶切電泳，如圖4所示，回收所需片段大小為11676 bp。

圖4 質粒pL-CRISPR.EFS.GFP酶切電泳結果

3.2 重組質粒的測序結果

將連接產物轉化后擴增培養，進行Towndown PCR菌液鑒定，選取的陽性克隆送至公司測序，結果顯示靶序列成功重組到空載體上。將測序結果導入Vector NTI進行比對圖5中A圖所示，方框內序列正是插入的目的序列，并分析堿基峰值圖5中B圖所示，峰值圖無雜峰，結果顯示成功將Kcnk2片段插入pL-CRISPR.EFS.GFP質粒的指定位置。

A)CRISPR-Kcnk2測序結果與酶切后pL-CRISPR.EFS.GFP質粒序列比對圖；B)CRISPR-Kcnk2載體的堿基峰值圖。紅色方框內為所插入片段，與目的基因Kcnk2片段完全一致，CRISPR-Kcnk2敲除載體成功構建

圖5CRISPR-Kcnk2敲除載體測序結果

4 結論與展望

本文應用CRISPR/Cas9基因編輯工具，成功構建Kcnk2基因敲除載體。相比于傳統檢測方式，采用Touchdown PCR方法進行陽性克隆篩選，將挑選的陽性克隆進行測序，縮短了檢驗時間，也降低了成本。Kcnk2基因編碼TREK1鉀通道，越來越多的研究表明TREK1與很多疾病密切相關，如抑郁癥、癲癇、疼痛等神經系統疾病、心血管疾病和肺部疾病等，也一直作為各大疾病的潛在治療靶點被科學工作者們不斷深入的研究。Kcnk2基因敲除載體的成功構建，也為實驗室后續探究Kcnk2在相關疾病中的作用奠定實驗基礎。