芒果苷改善肝損傷模型小鼠肝功能實驗研究

陳 星 ，夏曉冬 ，童德銀 ，車道標 ，2

（1.江蘇省宿遷市第一人民醫院，江蘇 宿遷 223800； 2.江蘇省人民醫院，江蘇 南京 210029）

肝纖維化發病機制復雜，與活化的肝星狀細胞沉積細胞外基質有密切關系[1-2]。肝星狀細胞活化過程中產生大量的促炎因子、趨化因子和分子，許多炎性因子在肝星狀細胞的活化中起著關鍵作用，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素 1β（IL-1β）和白細胞介素 6（IL-6）[3]。此外，核因子κB（NF-κB）、活性氧、脂質過氧化產物和多種生長因子也促進肝星狀細胞的增殖，與增加的肌成纖維細胞共同作用，最終導致肝纖維化的多種信號通路的病理生理改變。轉化生長因子β（TGF-β）等分子靶標在肝臟纖維化中具有重要意義。TGF-β是生長因子基因超家族中特征性細胞因子[4-5]，分布廣泛，被認為是強有力的促纖維化介質，可促進肝星狀細胞的活化和細胞外基質蛋白的沉積，從而導致肝纖維化[6]。同時，TGF-β與肝硬化的發展密切相關，可刺激細胞外基質蛋白的產生并消除基質蛋白的去除現象[7-9]。芒果苷是芒果葉的主要成分，是一種四羥基吡酮的碳糖苷，屬雙苯吡酮類化合物，具有抗炎和神經保護等多種藥理特性[10]。本研究中探討了芒果苷對四氯化碳肝損傷模型小鼠的保護作用。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物、儀器與試藥

動物：無菌級ICR小鼠50只，雄性，8～12周，購自上海西普爾必凱實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號 SCXK（滬）2008-0016。所有動物于室溫（22 ± 1）℃，空氣相對濕度40% ～50%，晝夜交替12 h，普通飼料喂養，自由進食、飲水。

儀器：UV-3200S型紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；680型酶標儀（美國Bio-Rad公司）；BH-2型光學顯微鏡（日本 Olympus公司）；DYCZ-24KS型電泳儀（北京六一儀器廠）。

試藥：芒果苷（美國Sigma公司，批號為111607-200301）；所有抗體均購自 Cell Signaling Technology；TNF-α，IL-6，IL-1β 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（批號分別為 20060922，20060925，20060926），均購自南京凱基生物技術公司；天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）和丙氨酸氨基轉移酶（ALT）試劑盒（批號分別為20160514，20161157）均購自南京建成生物工程研究所；蘇木素-伊紅染液（HE，北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 方法

分組、給藥與建模：將50只ICR小鼠隨機分為5組，即空白對照組（A組，等體積0.9%氯化鈉溶液）、模型組（B組，等體積0.9%氯化鈉溶液）、水飛薊素組（C組，0.1 g／kg）和芒果苷低、高劑量組（D1組、D2組，20，40 mg／kg），各10只。上述后4組小鼠皮下注射四氯化碳 -橄欖油（1 ∶1，V／V)，3 mL／kg，每周 2 次，連續6周，以建立小鼠肝纖維化模型。空白對照組小鼠皮下注射等量橄欖油。建模成功后，各組小鼠灌胃相應藥物，每天1次，連續6周。

肝臟組織病理學檢查：小鼠眼眶取血后處死，將肝臟組織固定于4%中性福爾馬林溶液中過夜。將組織固定包埋于石蠟中，切成4 mm厚的切片。然后去石蠟，HE染色，采用光學顯微鏡觀察肝臟病理改變情況。

AST和ALT活性檢測：采用干化學法和全自動生化分析儀檢測小鼠血清AST和ALT活性，嚴格按試劑盒說明書步驟操作。

TNF-α，IL-1β，IL-6含量檢測：采用 ELISA 法檢測小鼠血清 TNF-α，IL-1β，IL-6含量。嚴格按試劑盒說明書步驟操作。

炎性相關因子蛋白表達水平檢測：采用Western blot法檢測。將小鼠肝組織剪碎，取50 mg，加1 mL RIPA裂解液提取總蛋白，12 000 r／min離心15 min，收集上清液，采用BCA試劑盒進行蛋白定量。各組取20 μg上樣，轉膜至PVDF膜上，5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST清洗3次，加入一抗，4℃ 孵育過夜，回收一抗，TBST清洗4次，加入二抗，室溫振搖2 h，回收二抗，TBST清洗4次，加入ECL化學發光試劑，將PVDF膜放入暗盒中，壓上X膠片，取出膠片后顯影、定影、清洗。然后，通過Image J軟件將條帶灰度值數字化，目的條帶與內參條帶灰度比值為各目的蛋白相對表達水平。

1.3 統計學處理

采用SPSS 20.0統計學軟件分析。計量資料以 X±s表示，行 t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對肝組織病理形態學的影響

A組小鼠肝臟中央靜脈和周圍肝細胞結構正常。B組小鼠肝組織細胞存在氣球樣變性和脂肪變化，上述氣球樣變性和脂肪變化與纖維結締組織鏈和嚴重炎性細胞浸潤相關。C組和D1組、D2組上述肝組織病理形態學均有不同程度改善。詳見圖1。

2.2 其他觀察指標

結果見表1和圖2。與A組比較，B組小鼠肝組織勻漿中正Nod樣受體蛋白3（NLRP3），凋亡相關斑點樣蛋白（ASC），含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 1（Caspase-1），IL-1β，p-P65，P65，核因子 κB 抑制因子 α（IκBα），TGF- β，p-Samd-3，Smad-3 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01）；與 B組比較，C組和D1組、D2組小鼠肝組織勻漿中蛋白表達水平均顯著降低（P ＜0.01）。

3 討論

圖1 肝組織病理形態學（×200）

表1 各組小鼠血清轉氨酶活性和炎性因子水平比較（X ±s，n＝10）

圖2 肝組織勻漿中相關炎性因子蛋白表達

抑制炎癥相關途徑是治療肝纖維化的有效靶點。本研究結果顯示，芒果苷可通過抑制 NLRP3，ASC，Caspase-1的表達，降低 p-P65和p-IκBα的生成，抑制TGF-β和p-Samd-3在肝組織中的表達，從而抑制NLRP3炎癥小體反應。四氯化碳已被廣泛用于實驗性誘導肝纖維化[11-12]，其產生過量自由基，導致肝細胞膜脂質過氧化，隨后釋放炎性細胞因子和損傷肝細胞。本研究結果顯示，20 mg／kg和40 mg／kg芒果苷能顯著改善模型小鼠ALT、AST、炎性細胞因子水平和肝組織病理形態等。

炎性過程為涉及成纖維過程的主要事件[13]。肝臟損傷時，肝巨噬細胞可激活NF-κB及其下游信號傳導。NF-κB作為轉錄因子，上調多種炎性細胞因子的釋放，包括 TNF-α，IL-6，IL-1β。TNF-α，IL-6，IL-1β，進一步維持炎性級聯反應。本研究結果顯示，四氯化碳可增加小鼠血清 TNF-α，IL-6，IL-1β含量，升高p-IκBα表達水平，從而加重肝臟炎癥和纖維化[14]。20 mg／kg和 40 mg／kg芒果苷能顯著降低模型小鼠TNF-α，IL-6，IL-1β 的水平，對 NF-κB 信號轉導也有明顯的抑制作用。

TGF-β可促進肝星狀細胞的活化和細胞外基質蛋白的積累，導致肝纖維化，其過量產生會刺激細胞外基質蛋白的各種成分的合成和釋放。一旦激活，TGF-β結合到Ⅰ型和Ⅱ型絲氨酸／蘇氨酸激酶受體，將激活受體調節的SMAS，包括Smad-3。活化Smads的核易位是操縱TGF-β依賴基因的基本過程。TGF-β／Smad信號通路失活可能是抗肝纖維化的一個有前途的治療靶點。本研究結果顯示，在四氯化碳處理的小鼠中，TGF-β和Smad-3磷酸的表達水平升高，20mg／kg和 40 mg／kg芒果苷可顯著抑制Smad-3和TGF-β的磷酸化。

綜上所述，芒果苷對肝損傷模型小鼠具有一定改善作用，其機制與降低炎性反應有關。參考文獻：

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