印度梨形孢液體發酵產物的制備及其在日本青蔥上的應用

劉慧春，朱開元，張加強，譚晨，周江華，李明江，田丹青

(浙江省農業科學院 花卉研究開發中心，浙江 杭州 311202)

印度梨形孢(Piriformosporaindica)是印度科學家Verma等[1]于1998年在印度西北部的塔爾沙漠中發現的一種新生物菌，該菌能在人工培養基上培養[2]，且寄主廣泛。研究發現，印度梨形孢可定殖于多種作物的根部，如擬南芥、煙草、大麥、小麥、玉米等[3-7]，甚至能夠在叢枝菌根真菌(AMF)不能定殖的十字花科作物上定殖[8]，故可廣泛應用于農業上。研究發現，印度梨形孢能促進植物生長，加快植物對氮、磷等礦物質的吸收，提高大麥、小麥等糧食作物產量[9-12]。因此，印度梨形孢真菌被認為是一種生物防治因子和土壤改良因子，具有廣闊的科研和商業開發前景。

印度梨形孢的培養通常采用的是Kafer培養基[13]，但卻適合于實驗室小型試驗階段，由于生長速度較慢，不能滿足生產上大批量定期定量對印度梨形孢生物菌肥的需求，因此需要通過有效手段來促進印度梨形孢的液體培養產量，同時提高代謝物的作用。本研究采用不同的培養基配方，并在印度梨形孢特定的發酵階段加入不同來源的冷激蛋白和不同外源物，研究不同培養基配方和培養方法對提高印度梨形孢發酵產物的效果，并將獲得的印度梨形孢發酵產物應用于蔬菜日本青蔥的育苗階段，研究了印度梨形孢對日本青蔥的促生增產效應。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試材為日本青蔥，生長于浙江省杭州市蕭山區舒蘭農業有限公司臨江工業園蔬菜種植基地；供試菌株為印度梨形孢，由臺灣大學葉開溫教授惠贈；冷激蛋白的來源有3種菌株：枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、大腸桿菌(Escherichiacoli)和嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)，由浙江省林科院提供。

1.2 培養基配方

PDA平板培養基。馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，用水定容至1 000 mL，自然pH，在121 ℃下滅菌20 min。

液體種子培養基。葡萄糖5～20 g，酵母粉4 g，蛋白胨3 g，KH2PO41 g，MgSO40.5 g，定容至1 000 mL，自然pH，在121 ℃下滅菌20 min。

固體培養基。玉米粉0.3%～0.9%，牛肉浸膏0.1%～0.6%，K2HPO40.10%～0.25%，MgSO40.05%～0.15%以及余量的水，自然pH，在121 ℃下滅菌20 min。

液體發酵培養基。葡萄糖15 g，玉米粉4 g，牛肉浸膏3 g，KH2PO41.0 g，MgSO40.55 g，定容至1 000 mL，自然pH，在121 ℃下滅菌20 min。

1.3 印度梨形孢的活化培養

將斜面保藏的印度梨形孢菌種接種到PDA平板培養基上，在22～28 ℃下活化培養4～15 d，獲得活化后的印度梨形孢菌種。

1.4 冷激蛋白的制備

將冷激蛋白的3種來源的菌株從37 ℃降至15 ℃分別培養1、12和20 min，將菌體放入勻漿機中，在60 MPa下勻漿2次，加入占菌體質量1%～3%的木瓜蛋白酶，在40～50 ℃下酶解1 h，3～5 ℃下12 000 rpm離心20 min，收集上清液；上清液采用截留分子質量為2～5 kD膜超濾，截留液調pH至5.0，過夜，12 000 rpm離心20 min，將離心上清液真空冷凍干燥得到蛋白樣品，將其溶于0.02 mol·L-1Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液中配成20 mg·mL-1溶液，上樣于葡聚糖凝膠過濾柱Sephadex G-25，用0.01 mol·L-1Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液洗脫，流速0.5 mL·min-1，每管收集2 mL，自動收集洗脫液并于紫外280 nm檢測并收集組分，通過真空冷凍干燥得到來源于不同菌株的冷激蛋白。

1.5 發酵產物的制備

1.5.1 液體種子液

取1～3 cm2大小活化后的印度梨形孢菌種接種于1 L液體種子培養基中，在22～24 ℃培養1～9 d，得到印度梨形孢液體種子液。

1.5.2 固體發酵培養

將1.5.1中印度梨形孢液體種子液按占固體培養基體積5%～15%的用量接入添加有外源物的固體培養基中，在18～28 ℃下培養1～15 d后，將培養產物真空冷凍干燥、粉碎后得外源物固體發酵培養物；外源物分為3種：生地和梔子經粉碎后得到的生地小塊和梔子小塊、生地經粉碎后得到的生地小顆粒、梔子粉碎后的梔子粉末；每升固體培養基中添加不同量的外源物。

1.5.3 液體發酵培養

將1.5.1中印度梨形孢液體種子液按占液體發酵培養基體積3%～12%的量接種于添加有外源物固體發酵培養物的液體發酵培養基中，在18～28 ℃下培養1～5 d后加入不同來源的冷激蛋白，然后調整溫度在15～25 ℃繼續培養1、5和12 d，終止發酵后，得到印度梨形孢發酵產物。液體發酵培養基中外源物固體發酵培養物的添加量為0.8～9.0 g·L-1，液體發酵培養基中冷激蛋白的添加量為0.2～5.0 mg·mL-1。

1.6 生物量測定

對照和處理各3個重復，每個重復取1 L印度梨形孢的發酵產物進行過濾，將過濾后的菌絲體瀝干后稱重，獲得的菌絲體重量即為印度梨形孢發酵產物的生物量(g·L-1)，最后取平均值。

1.7 發酵產物在日本青蔥上的施用

將印度梨形孢發酵產物進行過濾、瀝干并稱重，稱取3 g菌絲體加入到盛有500 mL水的榨汁機中，炸碎直至肉眼看不到絮狀菌絲體，然后定容至1 L。稀釋10倍后噴施到日本青蔥幼苗上，以噴施清水作為對照，每周噴施1次，2個月后調查統計日本青蔥的蔥管數、株高、根系數、鮮重、干重等各項形態指標。

2 結果與分析

2.1 不同培養基配方和制備方法對印度梨形孢生物量的影響

將不同的培養基配方和制備方法獲得的印度梨形孢發酵產物進行生物量測定，獲得如表1的結果。

從表1可以看出，與常規培養方法(對照)相比，采用本研究方法(處理)發酵培養的印度梨形孢生物量分別提高56.0%、81.5%、66.9%、59.5%和80.0%，均達到極顯著差異。在本研究制備方法限定的范圍內，各參數的變化并不影響印度梨形孢液體發酵代謝產物產量的提高，因此本研究制備方法中任意參數的組合均可實現印度梨形孢液體發酵代謝產物產量的提高，其中尤以處理2效果最好，在生物量提高的同時，其生長周期縮短24 d。

2.2 印度梨形孢發酵產物對日本青蔥生長的影響

以處理2的培養基配方和制備方法，培養和制備印度梨形孢的發酵產物，并將獲得的印度梨形孢菌體經炸碎、稀釋后，噴施到日本青蔥的幼苗上。從蔥播種后1周開始噴施，每周施用1次，2個月為1個周期，其他正常管理，以清水作為對照。噴施8次后，從田間隨機取樣，對照和處理各取2組，每組30株，進行調查，調查指標包括株高、莖干直徑、蔥管數、根系數、根系長、鮮重和干重等。

從圖1可以看出，印度梨形孢能夠明顯促進日本青蔥的營養生長，與對照相比，無論是株高、莖干直徑還是蔥管數都得到明顯提高。

表1 不同培養基配方及制備方法下印度梨形孢的生物量

注：1：PDA培養基；2：液體種子培養基；3：固體培養基；4：液體種子液；5：固體發酵；6：液體發酵；7：生物量測定。

A，經粉碎后得到的生地小塊；B，粉碎后的梔子小塊；C，粉碎后的生地小顆粒；D，粉碎后的梔子粉末；E，粉碎后的生地糊；F，粉碎后的梔子糊。a，枯草芽孢桿菌；b，大腸桿菌；c，嗜熱鏈球菌。

圖1 印度梨形孢對日本青蔥生長的影響

從表2也可以更加明確地看出，噴施過印度梨形孢的日本青蔥各項生長指標均比對照高，其中株高分別比對照高出5.8%和16.9%，莖干直徑分別比對照高出16.1%和34.3%，蔥管數分別比對照高出32.4%和43.3%，根系長分別比對照高出6.9%和7.0%，根系數分別比對照高出20.2%和22.7%。

噴施印度梨形孢能明顯提高日本青蔥的產量(表3)，單株鮮重和30株鮮重分別比對照要高出51%和43%，每667 m2最高可增產600 kg。

表2 印度梨形孢對日本青蔥生長指標的影響

表3 印度梨形孢對日本青蔥產量的影響

3 討論

來源于沙漠的印度梨形孢是具有多種生物功能的內生真菌，在農業生產上具有潛在的應用價值。印度梨形孢最經典的培養基是Kafer培養基，然而印度梨形孢在該培養基上生長速度較慢，并不能滿足生產上大批量定期定量的對印度梨形孢的需求。為了提高印度梨形孢的生長速度，急需對其培養基配方和培養條件進行優選和改良。有研究通過在Kafer培養基中加入蛋白胨和酵母提取物等來提高印度梨形孢的生物量[14]。另外，碳源對印度梨形孢的生長也非常重要，一般利用多糖作為碳源，其中葡萄糖為最佳碳源[15]。本研究以葡萄糖作為碳源，并在培養基中加入蛋白胨、酵母粉和牛肉浸膏等附加物，促進印度梨形孢的生長速度。

冷激蛋白(cold shock domain proteins，CSPs)是廣泛存在于生物體中的一種應激蛋白，在細菌、植物與動物中均有發現，是一類高度保守的核酸結合蛋白，其通過RNA分子伴侶活性參與轉錄、翻譯、生長發育及逆境脅迫應答等細胞生理活動，從而達到一定的細胞增殖作用[16]。本研究根據印度梨形孢代謝產物合成代謝途徑的特點，利用生地、梔子中的有效成分，經印度梨形孢固體發酵和液體發酵工藝，并在特定的發酵階段添加冷激蛋白，一方面提高了印度梨形孢的生物量，另一方面縮短了印度梨形孢的制備周期，相比常規法，其生物量提高55.99%～81.51%，生長周期縮短12～26 d。

Verma等[17]報道，印度梨形孢對寄主植物玉米、煙草等均有促生作用。近幾年，也有關于印度梨形孢對農作物產生促生增產作用的報道。例如印度梨形孢能夠定殖于小白菜、水稻、油菜等農作物[18-20]，促進這些作物的生長，并達到增產的效果。究其原因，可能是由于印度梨形孢定殖于植物根系后，能夠調節寄主植物根系內源激素如GA含量的增加，進而促進根系的生長，根系生長旺盛了，對營養的吸收加強、對逆境的抵抗力也增強，從而起到促進植物生長并達到增產的作用。印度梨形孢自身也能產生分泌物質，如A-淀粉酶和蛋白酶，這些分泌物質能夠促進植物的生長[14]。本研究印度梨形孢的發酵產物中，也有其分泌的激素和蛋白，這些均可能是促進日本青蔥營養生長的有益物質，具體有待進一步展開深入的研究。