普通白菜作為替代基質(zhì)解決液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜基質(zhì)效應(yīng)的可能性

吳淑春，程珊莉，梁赤周，狄珊珊，虞淼，徐永，王新全，韓劍眾

(1.浙江工商大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310018； 2.杭州醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021； 4.浙江省農(nóng)藥檢定管理總站，浙江 杭州 310020)

農(nóng)藥殘留一直是農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全所關(guān)注的焦點(diǎn)問題[1-2]，不僅對(duì)人們的身體健康有著不可忽視的威脅力，同時(shí)對(duì)中國農(nóng)產(chǎn)品的出口帶來非常大的影響。基質(zhì)效應(yīng)是農(nóng)藥殘留檢測(cè)中重要的影響因素之一，由于基質(zhì)效應(yīng)的存在，使得農(nóng)藥殘留檢測(cè)的結(jié)果準(zhǔn)確度有所降低，會(huì)影響目標(biāo)化合物的峰形、響應(yīng)值，進(jìn)而影響方法的準(zhǔn)確度及靈敏度[3]，因此減小基質(zhì)效應(yīng)的影響至關(guān)重要。目前，QuEChERS方法成為農(nóng)藥殘留分析中的常用方法，能夠有效減少有機(jī)溶劑的使用，使樣品前處理步驟得到簡(jiǎn)化、節(jié)約時(shí)間，適合于氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)分析[4-5]。為了提高分析結(jié)果的精準(zhǔn)度，越來越多的研究致力于降低或消除基質(zhì)效應(yīng)[6-8]。基質(zhì)匹配標(biāo)樣為解決基質(zhì)效應(yīng)的首選方法，但由于蔬菜、水果種類眾多，篩選每種樣品的空白基質(zhì)將耗費(fèi)大量的人力和物力，同時(shí)兼顧檢測(cè)效率，因此很難一一匹配進(jìn)行基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液定量。選擇一種合適的替代基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液輔助溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量，將解決大部分由基質(zhì)效應(yīng)導(dǎo)致的定量問題。因此，本研究選擇11種代表性的蔬菜、水果和食用菌樣品，經(jīng)QuChERS方法處理后，LC-MS/MS分析39種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)。通過對(duì)比，利用主成分分析(PCA)篩選適合作為替代基質(zhì)的樣品，系統(tǒng)的評(píng)價(jià)其輔助溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液解決基質(zhì)效應(yīng)的可能性。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(AB 4500，AB-SCIEX)；臺(tái)式離心機(jī)(Thermo)；Filter Unit濾膜(0.22 μm)。分析純氯化鈉、無水硫酸鎂等均購自華東醫(yī)藥有限公司；甲醇、乙腈(色譜純， Merck)；甲酸銨HPLC級(jí)(Tedia)；PSA、C18(Agela Technologies)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。39種農(nóng)藥分析標(biāo)準(zhǔn)品購于上海農(nóng)藥研究所或農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所。選擇的代表性蔬菜樣品為芹菜、普通白菜、番茄、豇豆、辣椒、大蒜、韭菜，水果樣品為蘋果、葡萄、草莓，食用菌樣品為金針菇。

1.2 QuChERS方法的樣品前處理過程

稱取樣品(10.00±0.05)g于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入10 mL乙腈，渦旋1 min，然后加入1.5 g NaCl和4 g無水MgSO4，渦旋1 min，7 000 r·min-1離心3 min，準(zhǔn)確移取乙腈萃取上清液1 mL加入到含有50 mg PSA、50 mg C18和0.15 g無水MgSO4的2 mL離心管中，劇烈震蕩后渦旋1 min， 7 000 r·min-1離心3 min。取0.5 mL上清液轉(zhuǎn)移至含有0.5 mL水的離心管(2 mL)中，混勻，過0.22 μm濾膜，待LC-MS/MS分析。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。用空白基質(zhì)提取液將化合物混標(biāo)逐級(jí)稀釋成濃度為160、120、80、40、10和1 μg·L-1的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。

溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。用乙腈/水(1∶1，V∶V)溶液將化合物混標(biāo)逐級(jí)稀釋成濃度為160、120、80、40、10和1 μg·L-1的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 LC-MS/MS分析方法

基于LC-MS/MS(AB 4500)分析樣品中的39種農(nóng)藥。色譜柱為Kromasil 100-C18(2.1×100 mm，1.8 μm)，流動(dòng)相為A：甲醇，B：5 mmol·L-1乙酸銨和0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫程序?yàn)?.0 ～ 2.0 min，80%B，10.0 min，5%B，13.5 min，5%B，13.6 min，80%B，16.0 min，80%B。流速為0. 35 mL·min-1，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量2 μL。

質(zhì)譜條件。采用電噴霧離子源(ESI)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)，加熱溫度450 ℃，噴霧電壓為正源5 500 V，負(fù)源4 500 V。化合物質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 目標(biāo)化合物的LC-MS/MS參數(shù)

注：*為定量離子。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品中39種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

基質(zhì)效應(yīng)是農(nóng)藥殘留檢測(cè)中重要的影響因素之一，可能對(duì)目標(biāo)物的檢出造成一定的影響，導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性、靈敏度降低等結(jié)果。樣品中除分析物外其他所有組分的存在會(huì)影響分析物的電離效率，減小或者增大分析物的響應(yīng)值，被稱作基質(zhì)效應(yīng)[9]。基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線方程斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線方程斜率比(Slope ratio，SR)為評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)的常用方法，可用比值或其百分?jǐn)?shù)表示。若SR=100，表明無基質(zhì)效應(yīng)；若SR<100，為基質(zhì)抑制效應(yīng)；若SR>100，為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。當(dāng)80%≤SR≤120%時(shí)，為弱基質(zhì)效應(yīng)，對(duì)結(jié)果定量影響不大；當(dāng)50%≤SR<80%或120%150%，為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，將嚴(yán)重干擾結(jié)果定量。

11種代表性樣品經(jīng)QuEChERS方法處理后，LC-MS/MS分析結(jié)果表明(圖1)，選擇的蔬菜、水果和食用菌樣品均存在基質(zhì)效應(yīng)，并以基質(zhì)抑制為主，約75%化合物基質(zhì)效應(yīng)為抑制，25%為增強(qiáng)，其中22.4%為中等抑制效應(yīng)，6.6%為強(qiáng)抑制效應(yīng)，6.4%為中等增強(qiáng)效應(yīng)，1.5%為強(qiáng)增強(qiáng)效應(yīng)。基質(zhì)效應(yīng)較強(qiáng)的化合物分別為滅蠅胺、涕滅威、多效唑、蟲酰肼、滅幼脲、吡唑嘧菌酯、甲維鹽和阿維菌素。

圖1 不同樣品經(jīng)QuEChERS方法處理后經(jīng) LC-MS/MS測(cè)定時(shí)的基質(zhì)效應(yīng)

進(jìn)一步分析結(jié)果如圖2所示，11種代表基質(zhì)中弱基質(zhì)效應(yīng)為64%，中等基質(zhì)效應(yīng)為28.8%，強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)為7.2%。其中芹菜、普通白菜、番茄、豇豆、辣椒、大蒜、韭菜、蘋果、葡萄、草莓和金針菇中等基質(zhì)效應(yīng)的化合物分別為30.8%、28.2%、12.8%、28.2%、25.6%、48.7%、43.6%、28.2%、12.8%、15.4%和38.5%，強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)分別為5.1%、5.1%、7.7%、7.7%、5.1%、28.2%、20.5%、2.6%、2.6%、2.6%和0。在所選的基質(zhì)中，大蒜和韭菜的基質(zhì)效應(yīng)較強(qiáng)，不適合作為替代基質(zhì)；芹菜、普通白菜、豇豆、辣椒、蘋果的基質(zhì)效應(yīng)分布相似，弱基質(zhì)效應(yīng)為主，中等基質(zhì)效應(yīng)其次，存在少量的強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，可以嘗試作為替代基質(zhì)，但僅通過數(shù)據(jù)比較很難篩選；金針菇樣品僅存在弱和中等基質(zhì)效應(yīng)，而番茄、葡萄和草莓樣品的基質(zhì)效應(yīng)均較弱，不能代表大多數(shù)樣品的基質(zhì)效應(yīng)情況，不適合作為替代基質(zhì)。單純的數(shù)據(jù)分析存在一定的偏差性，很難篩選合適的替代基質(zhì)。本研究采用主成分分析(PCA)方法進(jìn)一步的分析確證，以期找到合適的替代基質(zhì)。

圖2 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

2.2 替代基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的篩選及基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

通過PCA分析(圖3)可以發(fā)現(xiàn)，大蒜和韭菜較為分散，與其較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果一致；其他蔬菜和水果較為集中，其中普通白菜處于中間位置，可以嘗試作為替代基質(zhì)進(jìn)行研究。如圖2所示，選擇普通白菜作為替代基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，中等和強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)有明顯改善，其中普通白菜全部改善，芹菜、番茄、豇豆、辣椒、大蒜和韭菜香蕉分別改善了50.0%、12.5%、50.0%、58.3%、23.3%和24.0%；但蘋果、葡萄、草莓、金針菇基質(zhì)效應(yīng)沒有改善，故普通白菜不適合用于水果和食用菌樣品的基質(zhì)效應(yīng)校正。除去這4種基質(zhì)，其他代表性基質(zhì)樣品的中等和強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)均有明顯降低，中等基質(zhì)效應(yīng)由31%降至16%，強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)由11%降至8%。但選擇普通白菜作為替代基質(zhì)時(shí)，氯蟲苯甲酰胺的基質(zhì)效應(yīng)明顯增強(qiáng)，由弱抑制基質(zhì)效應(yīng)變成強(qiáng)增強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，將嚴(yán)重影響結(jié)果準(zhǔn)確度。由于PCA分析中大蒜和韭菜較為分散，普通白菜作為替代基質(zhì)使大蒜和韭菜的基質(zhì)效應(yīng)改善明顯，分別改善了23%和24%，但2種蔬菜和其他代表性蔬菜、水果、食用菌相比，基質(zhì)效應(yīng)仍然較強(qiáng)。綜上，在分析代表性的蔬菜樣品中農(nóng)藥殘留分析時(shí)，選用白菜基質(zhì)輔助溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校正，可改善中等和強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)問題，但不適用于水果和食用菌樣品，對(duì)于受基質(zhì)影響顯著的化合物建議使用同種樣品基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量分析。

圖3 通過PCA評(píng)價(jià)代表性蔬菜、水果和 食用菌樣品基質(zhì)效應(yīng)

3 小結(jié)

本研究對(duì)11種代表性的蔬菜、水果和食用菌樣品中39種農(nóng)藥，選用QuChERS進(jìn)行前處理后，結(jié)合LC-MS/MS分析評(píng)價(jià)不同農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)差異。結(jié)果表明，化合物基質(zhì)效應(yīng)以基質(zhì)抑制為主，約75%為抑制，25%為增強(qiáng)，其中中等基質(zhì)效應(yīng)為28.8%，強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)為7.2%。選擇普通白菜作為替代基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，蔬菜水果樣品的中等和強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)均有不同程度的改善，普通白菜、芹菜、番茄、豇豆、辣椒、大蒜和韭菜的基質(zhì)效應(yīng)分別改善了100.0%、50.0%、12.5%、50.0%、58.3%、23.3%和24.0%，但蘋果、葡萄、草莓、金針菇的基質(zhì)效應(yīng)沒有改善。除去這4種基質(zhì)，其他代表性基質(zhì)樣品的中等和強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)均有明顯降低，中等基質(zhì)效應(yīng)由31%降至16%，強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)由11%降至8%。因此，選用普通白菜基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液在農(nóng)藥殘留分析時(shí)輔助溶劑準(zhǔn)溶液標(biāo)進(jìn)行校正，可改善蔬菜樣品的中等和強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，但對(duì)于受基質(zhì)影響顯著的農(nóng)藥建議使用同種樣品基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量分析。