8個秀珍菇菌株遺傳親緣關系初步分析

王偉科，陸娜

(杭州市農業科學研究院 蔬菜研究所，杭州 310024)

秀珍菇(Pleurotuspulmonarius)隸屬于真菌門、擔子菌綱、傘菌目、側耳科側耳屬，菇形秀小、漂亮，口感柔嫩，美味清爽，營養豐富，是近年來浙江省栽培面積最廣的珍稀食用菌之一，備受廣大消費者喜愛[1]。食用菌種質資源的收集分類鑒定是選育優良品種的前提和基礎。但秀珍菇菌株繁多，來源又各不相同，造成異種同名或同種異名現象的普遍出現，而傳統的形態學方法很難將秀珍菇菌株區別開來。因此，引入新的秀珍菇品種鑒定分析方法必不可少[2]。

近年來，分子標記技術已廣泛應用于藥用植物及食用大型真菌的分析。主要手段有ISSR、AFLP、RFLP、RAPD等[3]。ISSR分子標記技術具有操作簡單、模板需要量少、多態性豐富、結果記錄方便、成本低廉等優點，在物種遺傳多樣性鑒定、系統進化等多個領域得到普遍運用[4]。我們采用ISSR技術對8個秀珍菇菌株的遺傳多樣性進行分析鑒定，以期為秀珍菇品種選育中親本選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

菌株S1，杭州市農業科學研究院；菌株S2，浙江省農業科學院；菌株S3，杭州市農業科學研究院；菌株S4，杭州市農業科學研究院；菌株S5，臨安鼎新生物科技有限公司；菌株S6，浙江興森科技有限公司；菌株S7，武義海興生物科技有限公司；菌株S8，桐鄉西岸菌業。

1.2 培養基和培養方法

培養基。采用PDA培養基(葡萄糖20 g，馬鈴薯去皮200 g，水1 000 mL，pH值自然)。

培養方法。將參試菌株轉接于PDA固體培養基中，每個菌株轉接3個平皿，于(26±1)℃條件下培養10 d后用于DNA提取。

1.3 基因組DNA的提取

挑取菌絲提取DNA。DNA提取采用CTAB法[5]。提取的DNA經Nanodrop 2000 c定量和瓊脂糖凝膠電泳檢測純度后，保存于-20 ℃備用。

1.4 ISSR引物設計及合成

ISSR引物參考哥倫比亞大學公布的序列和Wolfe相關設計[6]，從中挑選出16條合適引物，引物由北京擎科生物技術有限公司合成，引物具體序列見表1。

1.5 ISSR分子標記鑒定

ISSR擴增體系根據各自引物退火溫度和Mg2+濃度進行優化，優化后體系含10×PCR buffer 2 μL、25 mmol·L-1MgCl21.2 μL、10 mmol·L-1dNTPs 0.5 μL、10 mmol·L-1ISSR引物1 μL、100 ng基因組模板DNA和1 U pfu DNA聚合酶，總體積20 μL。

表1 參試菌株ISSR引物參考序列

PCR擴增程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性20 s、46～52 ℃退火90 s、72 ℃延伸30 s、35個循環；72 ℃延伸7 min。其中，每個引物的退火溫度優先參考值為Tm值下調2 ℃。

1.6 擴增產物的檢測

取目標產物10 μL，加入6×上樣緩沖液1.5 μL，混勻后于1.5%瓊脂糖凝膠上電泳分離，拍照記錄。

1.7 數據采集分析

從凝膠成像系統得到的電泳譜帶中，選取清晰可辨的電泳條帶，以1和0記錄條帶的有或者無，在相同片段位置上存在擴增帶時，記錄為1，不存在時記錄為0，將圖形數據轉換成數字數據。并運用NTSYS-pc2.0軟件，根據SM相似系數法計算品種間的遺傳相似性，UPGMA進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 ISSR多態性

用來擴增秀珍菇的16條ISSR中，有8條獲得的ISSR帶型較好，各引物擴增獲得的條帶片段大小范圍較大，在500～5 000 bp；共擴增獲得207個DNA條帶，其中多態性條帶119條。引物P828、P974擴增的多態性比率最高，為100%；引物P826擴增的多態性比率最低，為15.8%(表2)。

表2 8條ISSR引物擴增結果

2.2 DNA指紋圖譜分析

在秀珍菇ISSR擴增DNA指紋圖譜(圖1)中：引物P841、P8288分辨力最高，對秀珍菇基因組DNA擴增效果最好；引物P828、P974擴增條帶多態性最高，表明用該ISSR引物建立的指紋圖譜用來區分秀珍菇遺傳背景較好。

M為DNA marker；S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8為8個秀珍菇菌株圖1 8個秀珍菇菌株的8條ISSR引物擴增圖譜

2.3 聚類分析

用NTSYS-pc2.0的UPGMA對秀珍菇ISSR結果進行聚類分析。結果表明，8份樣本可劃分為A和B 2大類群，其中，S1為單獨一個A類群，剩下為B類群。在B類中，遺傳相似系數為0.77處，S3單獨聚為一類，其余樣本聚為一類。在遺傳相似系數約0.82處，8份樣本可聚為4類，S1、S3各單獨聚為一類，S2、S5、S6聚為一類，S4、S7、S8聚為一類(圖2)。

圖2 8個秀珍菇樣本的UPGMA聚類結果

3 小結

秀珍菇由于長期的人工栽培和相互引種，使得秀珍菇“同種異名”“同名異種”的現象經常出現，僅從子實體外觀形態上很難進行準確區分，這不僅影響了秀珍菇品種鑒定的準確性，也會增加菇農選擇品種的困惑[7]。因此，菌株或品種間親緣關系研究和遺傳多樣性分析對于該屬食用真菌育種和生產都具有較為重要的意義，不僅可減少育種工作中親本選擇的盲目性，也能使菇農避免因栽培品種選擇錯誤而造成的經濟損失。

16條ISSR引物對8個秀珍菇品種的擴增結果表明，有8條ISSR引物獲得的帶型較好，多態性豐富，條帶清晰，共擴增出207個條帶，多態性條帶119條，表明秀珍菇種質之間存在豐富的遺傳多樣性。在DNA指紋圖譜中，引物P828、P974擴增條帶多態性最高，表明用該ISSR引物建立的指紋圖譜可較好地區分秀珍菇遺傳背景。

UPGMA聚類分析表明，8份樣本可劃分為2大類群，其中，S1為單獨一類，其余為一類。在遺傳相似系數為約0.82處，8份樣本可聚為4類，S1、S3各單獨聚為一類，S2、S5、S6聚為一類，S4、S7、S8聚為一類。這表明ISSR分子標記可以用于秀珍菇種質資源遺傳關系研究，有效地揭示秀珍菇種質資源間豐富的多態性和遺傳多樣性。