Notch信號通路配體Jagged1與DLL4在子癇前期孕婦胎盤組織中的表達及意義

王小艷 俞丁丁

子癇前期在世界范圍內的發病率為5%～10%，作為胎盤缺血性疾病，其病因復雜，嚴重影響患者妊娠結局[1]。目前，子癇前期的發病機制尚無定論，但子宮-胎盤血液循環障礙導致的胎盤缺血缺氧以及大量細胞因子被釋放進入母體血液循環在該疾病發生、發展中的重要作用已得到國內外學者的公認[2]。研究發現Notch信號通路能夠通過影響細胞增殖、分化和血管形成等活動起到調節胚胎發育的作用，其同源配體Jagged1與DLL4更是與胎盤血管形成和發育密切相關[3]。但目前將胎盤組織中Jagged1與DLL4表達水平聯合檢測應用于子癇前期患者的研究較少。本研究旨在探討Notch信號通路配體Jagged1與DLL4在子癇前期患者胎盤組織中的表達及其意義。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2013年5月至2017年3月在本院接受剖宮產術分娩的子癇前期孕婦73例，年齡21～38（29.3±4.2）歲，孕 1～3（1.8±0.6）次。所有患者均符合《妊娠期高血壓疾病診治指南》[4-5]中相關診斷標準，排除合并慢性高血壓、糖尿病、甲狀腺功能異常、其他重要臟器器質性病變者。根據病情，將73例孕婦分為中輕度子癇前期孕婦37例（輕度組）和重度子癇前期孕婦36例（重度組）。另選取同期正常妊娠且接受剖宮產術分娩的孕婦 35 例作為對照組，年齡 19～39（27.2±3.5）歲，孕 1～2（1.6±0.7）次。患者與對照組年齡、孕次比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 標本收集 3組孕婦均在剖宮產胎盤娩出后，立即從胎盤母體面中央切取2塊約1cm3大小的胎盤組織，注意避開梗死區與鈣化區。1塊胎盤組織保存于無菌凍存管中，放置于-80℃冰箱內保存；另1塊胎盤組織固定于4℃40g/L多聚甲醛溶液中。

1.2.2 胎盤組織中Jagged1、DLL4表達定位 采用免疫組化SP法。取固定胎盤組織進行常規石蠟包埋，4μm切片，內源性過氧化物酶使用3%過氧化氫清除。分別加入稀釋度為1∶50的Jagged1抗人一抗和DLL4抗人一抗（美國Santa Cruz公司），陰性對照以PBS代替一抗。操作步驟嚴格按照SP法說明書進行。使用病理圖像分析系統進行觀察并拍照。

1.2.3 胎盤組織中Jagged1、DLL4蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。取無菌凍存管中胎盤組織剪碎，將預冷裂解液加入進行冰上勻漿裂解1h。4℃下14 000g離心5min，取上清液，測定蛋白濃度。取50μg進行SDS-PAGE凝膠電泳，待分離后置于硝酸纖維素膜，分別加入小鼠抗人Jagged1抗體（1∶1 000）和小鼠抗人DLL4抗體（1∶800），4℃下孵育過夜。洗膜，加二抗，室溫下孵育1h。采用ECL法顯色，以GAPDH作為內參。灰度分析使用Bandscan 5.0軟件包。

1.3 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件。符合正態分布的計量資料以表示；不符合正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用 Kruskal-WallisH檢驗，兩兩比較采用Bonferroni法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胎盤組織中Jagged1、DLL4表達定位 在對照組（圖 1a-b）、輕度組（圖 1c-d）、重度組（圖 1e-f）孕婦胎盤組織中，Jagged1主要表達于絨毛滋養層細胞和血管內皮細胞，DLL4主要表達于血管內皮細胞。

圖1 胎盤組織中Jagged1、DLL4表達定位（a：對照組胎盤組織中Jagged1表達定位；b：對照組胎盤組織中DLL4表達定位；c：輕度組胎盤組織中Jagged1表達定位；d：輕度組胎盤組織中DLL4表達定位；e：重度組胎盤組織中Jagged1表達定位；f：重度組胎盤組織中DLL4表達定位；免疫組化SP法，×400）

2.2 3組孕婦胎盤組織中Jagged1、DLL4蛋白表達水平比較 3組孕婦胎盤組織中Jagged1、DLL4蛋白表達水平比較差異均有統計學意義（均P＜0.01）。對照組孕婦胎盤組織中Jagged1、DLL4蛋白表達水平均高于輕度組和重度組，輕度組孕婦胎盤組織中Jagged1、DLL4蛋白表達水平均高于重度組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表 1。

3 討論

Notch信號通路是單次跨膜蛋白家族的一員[6]，在脊柱動物中廣泛存在，并在胚胎發育、細胞增殖、分化、凋亡和血管形成中扮演重要角色[7]。由于其功能缺失會導致果蠅翅膀發生缺刻（Notchs），故得此命名。在哺乳動物中，該信號通路由同源受體（Notch1、Notch2、Notch3、Notch 4）、同源配體（DLL1、DLL3、DLL4、Jagged1、Jagged2）和CSL-DNA結合蛋白所組成。當相鄰細胞相互激活該通路時，細胞Notch受體與配體相結合，并釋放活化的Notch區域，該區域被轉移至細胞核，與轉錄因子CSL結合后對DNA起到調控作用[8]。

表1 3組孕婦胎盤組織中Jagged1、DLL4蛋白表達水平比較

近年來，大量研究發現Notch家族蛋白在胎盤組織中的表達與胎盤形成密切相關，尤其是同源配體Jagged1與DLL4[9]。Jagged1在正常胎盤組織的血管內皮細胞和絨毛滋養層細胞中呈高表達，而DLL4則在正常胎盤組織的血管內皮細胞中呈高表達。Santa等[10]研究發現胎盤血管內皮細胞中的Jagged1能夠促進血管出芽，與胎盤血循環過程密切相關。Grochowski等[11]研究發現，子癇前期孕婦胎盤組織中DLL4表達有所降低，推測DLL4具有抑制血管增生和促進血管成熟的作用，與Jagged1在血管形成方面具有一定拮抗作用，兩者共同促進胎盤血管生成發育。

本研究中，使用免疫組化SP法對胎盤組織中Jagged1與DLL4表達進行定位，結果與Spinner等[12]研究一致，提示Jagged1、DLL4與胎盤血管發育有關。胎盤富含血管，新生的血管網是胎盤正常發育和宮內胎兒正常生長的基礎。而子癇前期孕婦胎盤血管的形成和增殖被抑制，使胎盤局部血管網絡發育受限，導致血管數量下降、發育不足，產生胎盤血管重塑，從而導致胎盤缺血缺氧[13]。Otti等[14]研究發現Jagged1與DLL4在正常妊娠胎盤組織中具有較高的相關性，并可能存在動態平衡，前者增加新生血管數量，而后者則抑制無功能血管的過度增殖，并使其功能成熟。而本研究發現，與對照組孕婦比較，輕度組和重度組孕婦胎盤組織中Jagged1與DLL4蛋白表達水平均有不同程度下降，提示子癇前期孕婦胎盤組織中存在Jagged1與DLL4表達失衡，而該失衡導致的新生血管發育不足可能與子癇前期的發生有密切聯系。

綜上所述，子癇前期患者胎盤組織中Notch信號通路配體Jagged1與DLL4表達失衡，與子癇前期的發生、發展有一定聯系，但具體機制仍有待于進一步研究。兩者聯合檢測有望為子癇前期的防治提供新的靶點。