PCDH17基因甲基化檢測對胃癌早期診斷的價值研究

朱春霞 周善學 胡桂梅 葉國良

胃癌在亞洲尤其是中國非常普遍，是全球癌癥相關死亡的主要原因之一[1]。盡管胃癌診療技術的提高顯著延長了早期胃癌患者的生存率，但大多數胃癌患者診斷時已是中晚期，導致胃癌總體生存率不理想[2]。組織病理是診斷胃癌的金標準，但因其屬有創檢查而受到一定的

限制，不適用于大規模篩查。因此，迫切需要尋找有效分子標志物應用于胃癌早期無創篩查及輔助診斷。胃癌發生過程涉及眾多遺傳學和表觀遺傳學改變的累積，導致癌基因功能獲得和抑癌基因功能缺失。隨著研究的深入，越來越多的證據表明表觀遺傳學特別是DNA甲基化在胃癌發生、發展中發揮了重要作用[3-5]。DNA甲基化在不改變DNA序列的情況下產生穩定的可遺傳的基因表達改變，從而使體內抑癌基因功能缺失[6]。DNA甲基化狀態改變發生于胃癌早期，可在外周血中檢測其水平變化，用于早期無創篩查胃癌病變有一定優勢。原鈣黏附蛋白 17（protocadherin 17，PCDH17）位于 13q21.2，為鈣黏附蛋白超家族成員之一[7]。PCDH17在正常生理過程中發揮抑癌作用，但在多種腫瘤細胞中均因高甲基化致抑癌功能缺失[8-9]，而PCDH17基因甲基化與胃癌的關系鮮有報道。因此，本研究將探討胃癌中PCDH17基因甲基化水平，分析其與胃癌臨床病理特征的關系，評估其對胃癌的診斷價值。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2011年5月至2017年6月在本院普外科及消化內科住院治療的胃癌患者120例（普外科78例，消化內科42例），男84例，女36例；年齡44～89歲，中位年齡67歲；病理分化：高分化18例，中低分化102例；腫瘤大小＞5cm 57例，≤5cm 63例；病理分型：腺癌101例，印戒細胞癌19例；癌胚抗原表達陽性17例，陰性103例；糖類抗原19-9表達陽性19例，陰性101例；脈管侵犯陽性68例，陰性52例；淋巴管侵犯陽性54例，陰性66例；神經侵犯陽性55例，陰性65例；腫瘤浸潤深度：T1～2期 21 例，T3～4期 99 例；淋巴結轉移63例，無轉移57例；遠處轉移7例，無遠處轉移113例；采用國際抗癌聯盟/美國癌癥聯合委員會TNM分期標準（第8版）進行臨床Stage分期，其中Ⅰ～Ⅱ期56例，Ⅲ～Ⅳ期64例。所有患者納入標準：（1）均為初次就診，術前均未接受放化療；（2）既往均無腫瘤病史；（3）均由經驗豐富的病理醫師進行組織病理檢查確診為胃癌。排除標準：結合患者住院期間臨床資料，同時存在其他腫瘤（其他部位原位癌或非胃癌轉移癌）的患者。選取同期本院健康體檢者120例作為對照。本研究獲得醫院倫理委員會批準和患者知情同意。

1.2 細胞培養 正常胃黏膜上皮細胞株GES-1，胃癌細胞株MGC-803、AGS和SGC-7901來自武漢大學典型培養物保藏中心。上述細胞用含10%FBS的RPMI 1640培養基置于37℃、5%CO2培養箱中培養。待細胞處于對數生長時用于下一步實驗分析。

1.3 樣本收集、DNA提取和亞硫酸氫鹽修飾 將手術切除或內鏡下剝離的腫瘤組織及切緣正常組織立即存入液氮中，并及時保存于-80℃冰箱。120例胃癌患者的血漿標本來源于上述患者術前采集，120例正常血漿標本取自健康人群對照。抽取靜脈血后立即離心，3 000g離心10min，分離并得到血漿，-80℃凍存。應用QIAamp DNA Mini Kit（德國Qiagen公司）提取胃癌、對應癌旁正常組織標本及正常胃黏膜上皮細胞株GES-1、胃癌細胞株 MGC-803、AGS和 SGC-7901基因組 DNA。應用QIAamp DNA Blood Mini Kit（德國Qiagen公司）提取胃癌患者及健康體檢者的血漿樣本基因組DNA。應用紫外分光光度計測定DNA質量。應用ZYMO EZ DNA Methylation-Gold Kit（美國ZYMO研究公司）對提取的全基因組DNA進行亞硫酸氫鹽修飾。所有操作均嚴格按照產品說明書。

1.4 PCDH17基因甲基化水平測定 采用熒光定量甲基化特異性PCR法（quantitative methylation specific PCR，qMSP）。將經過亞硫酸氫鹽修飾過的樣本DNA作為模板，以β-actin作為內參基因，標準化目標DNA的量，應用SYBR Green熒光染料，檢測樣本中甲基化水平。實驗使用實時熒光定量PCR儀（LightCycler480，美國Roche公司）。qMSP過程所需引物：PCDH17正義：5′-GTTTGCCTTGC-TCTGGATGGTGG-3′，反義：5′-GTCCAGACCCAGATCTTCAGCGA-3′；β-actin 正義：5′-CCTAGAAGCATTTGCGGTGG-3′， 反 義 ：5′-GAGCTACG-AGCTGCCTGACG-3′。樣本PCDH17和β-actin均重復3次。qMSP反應體系為20μl，包括模板DNA 2μl，SYBR Green Master Mix 熒光染料 10μl，無 DNA 酶水6μl及上下游引物各1μl。qMSP反應條件為：95℃預變性 10min，95℃變性 20s，60℃退火 40s，72℃延伸 30s，循環50次。樣本PCDH17基因甲基化水平應用甲基化指數（percent of methylated reference，PMR）表示，其計算公式是：PMR=2-[（Ct樣本-Ct內參）]×100。

1.5 統計學處理 采用SPSS 18.0統計軟件。符合正態分布的計量資料以表示，正常胃黏膜上皮細胞和3株胃癌細胞PCDH17基因甲基化水平比較采用兩獨立樣本t檢驗。不符合正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，胃癌組織與對應癌旁正常組織PCDH17基因甲基化水平比較采用兩配對樣本的非參數檢驗；不同臨床病理特征的胃癌組織中PCDH17基因甲基化水平和胃癌患者與健康體檢者血漿樣本中PCDH17基因甲基化水平比較采用兩獨立樣本的非參數檢驗。采用ROC曲線分析PCDH17基因甲基化水平在胃癌診斷中的價值。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 正常胃黏膜上皮細胞和3株胃癌細胞PCDH17基因甲基化水平比較 正常胃黏膜上皮細胞GES-1 PCDH17基因甲基化水平為0.39±0.05，胃癌細胞MGC-803、AGS和SGC-7901 PCDH17基因甲基化水平分別為67.83±6.87、33.93±4.92 和 43.21±2.69，3 株胃癌細胞 PCDH17基因甲基化水平均明顯高于正常胃黏膜上皮細胞，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。

2.2 胃癌組織與對應癌旁正常組織PCDH17基因甲基化水平比較 胃癌組織中PCDH17基因甲基化水平為28.91（4.96，54.59），明顯高于對應癌旁正常組織的5.16（1.02，17.81），差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.3 胃癌組織中PCDH17基因甲基化水平與臨床病理特征的關系 胃癌組織中PCDH17基因甲基化水平與糖類抗原19-9表達情況、淋巴管侵犯、神經侵犯、淋巴結轉移和Stage分期均有關（均P＜0.05），而與患者性別、年齡、病理分化、腫瘤大小、病理分型、癌胚抗原表達情況、脈管侵犯、腫瘤浸潤深度和遠處轉移均無關（均P＞0.05），見表 1。

2.4 胃癌患者與健康體檢者血漿樣本中PCDH17基因甲基化水平比較 胃癌患者血漿樣本中PCDH17基因甲基化水平為32.56（5.59，53.86），明顯高于健康體檢者的 4.06（2.21，12.84），差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.5 PCDH17基因甲基化水平對胃癌的診斷價值 在胃癌組織中，PCDH17基因甲基化水平用于診斷胃癌的 AUC為 0.73，靈敏度為 0.58，特異度為 0.80，見圖1a。在血漿樣本中，PCDH17基因甲基化水平用于診斷胃癌的AUC為0.77，靈敏度為0.63，特異度為0.83，見圖1b。

3 討論

胃癌作為世界第五大惡性腫瘤之一，死亡率居高不下，嚴重威脅人類的健康[10]。目前，胃癌患者總體5年生存率偏低，晚期胃癌患者預后較差。而早期發現診斷胃癌是提高胃癌生存率的關鍵因素[11-13]。因此，尋找到早期診斷篩查的有效分子標志物對提高胃癌早期診斷率及生存率具有重要意義，并能獲得巨大的社會和經濟效益。

原鈣黏附蛋白（protocadherin，PCDHs）是鈣黏附蛋白超家族的新的亞家族，分為成簇的原鈣黏蛋白和非成簇的原鈣黏蛋白兩類[14]，主要參與細胞內信號傳導和細胞間的相互作用[15-16]。DNA異常甲基化是最常見的表觀遺傳學修飾之一，異常基因甲基化在腫瘤發生早期即可檢測到，可作為早期診斷和監測腫瘤的有效分子標志物[17]，亦可作為有效的預后風險評估指標[18-19]。Ying等[20]報道PCDHs在許多腫瘤中均發生高甲基化，如鼻咽癌、食管癌、乳腺癌、肝癌等。此外，PCDH8和PCDH20也分別在乳腺癌和非小細胞癌中發生高甲基化[21-22]。這提示PCDHs基因家族可能在腫瘤發生、發展過程中扮演抑癌基因的角色[23-24]。PCDH17是PCDHs家族的主要成員之一，主要介導細胞間黏附，具有抑制腫瘤生長的功能[25-26]。PCDH17作為一個新型抑癌基因，在許多腫瘤中因發生高甲基化而致功能缺失。Haruki等[25]報道PCDH17在食管癌中高甲基化且與食管癌的分化程度密切相關。在腎細胞癌中，PCDH17的甲基化水平同樣與其病理評分、臨床分期、淋巴結轉移和不良預后顯著相關[27]。在膀胱癌中同樣能夠檢測到高甲基化PCDH17，并與患者不良預后相關[9]。PCDH17基因甲基化水平不僅可作為多種腫瘤預后評判指標，也可作為腫瘤篩查診斷指標[7]。而本研究將探討PCDH17基因與胃癌的關系，評估其甲基化水平對胃癌的診斷效能。

表1 胃癌組織中PCDH17基因甲基化水平與臨床病理特征的關系

圖1 PCDH17基因甲基化水平用于診斷胃癌的ROC曲線（a：胃癌組織；b：血漿樣本）

本研究中，筆者首先從細胞及組織樣本兩個層面明確胃癌中PCDH17基因甲基化水平明顯升高。通過結合患者臨床資料分析發現，PCDH17基因甲基化水平在淋巴管侵犯、神經侵犯、淋巴結轉移和Stage分期Ⅲ～Ⅳ期患者中均明顯升高，表明PCDH17基因甲基化可能在胃癌疾病進展和轉移過程中發揮重要作用。癌組織基因的相關變化可在體液或分泌物（痰液、大便、血液等）中檢測到，并且在這些體液中的變化可以一定程度上反映組織中同一基因的變化情況[28-29]。因此，為評價PCDH17基因甲基化的早期無創篩查價值，筆者分別比較PCDH17基因甲基化在胃癌組織和血漿樣本中的診斷價值。結果發現在胃癌組織中，PCDH17基因甲基化水平用于診斷胃癌的AUC為0.73，靈敏度為0.58，特異度為0.80；在血漿樣本中，PCDH17基因甲基化水平用于診斷胃癌的AUC為0.77，靈敏度為0.63，特異度為0.83。結合上述結果，筆者認為PCDH17基因甲基化水平檢測具有無創、簡便、靈敏性較高的優勢，是輔助診斷胃癌較為理想的生物標志物。本研究尚存在一些局限性，尚未在胃癌癌前病變人群血漿樣本中檢測PCDH17基因甲基化水平，還需要進一步擴大PCDH17基因甲基化檢測的臨床應用范圍。

綜上所述，本研究證實了胃癌中PCDH17基因甲基化水平明顯增高，且在淋巴管侵犯、神經侵犯、淋巴結轉移和Stage分期Ⅲ～Ⅳ期患者中明顯升高。PCDH17基因甲基化水平可作為胃癌的早期無創篩查的生物標志物。