沙利度胺對宮頸癌裸鼠移植瘤的放療增敏作用及其機制研究

楊麗萍 侯俊德 劉凌凌 馬建彩 王玉紅 孟慧芳

宮頸癌是嚴重危害婦女健康和生命的最常見惡性腫瘤之一[1]，其發病率及病死率在我國呈上升趨勢，且日趨年輕化[2]。目前放療是宮頸癌的重要輔助治療手段，然而，腫瘤細胞本身對放療的敏感性較差，如何提高實體瘤的放療敏感性一直是放療生物學的重要課題。因此，尋找一種放療增敏劑是當前研究的熱點。有研究證實沙利度胺可增強食管癌、結腸癌細胞的放療敏感性[3-4]，但沙利度胺與宮頸癌放療敏感性關系的研究較少見。本研究通過建立人宮頸癌裸鼠移植瘤模型，觀察沙利度胺對宮頸癌的放療增敏作用，并探討其可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 細胞來源和實驗動物 人宮頸癌細胞株Hela親本細胞株來源于中國科學院上海細胞庫，由河北醫科大學細胞實驗中心提供。在含10%FBS的DMEM培養基中貼壁生長，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，每3～4d傳代一次。5周齡雄性BALB/c裸鼠20只，體重20～23g，購于河北醫科大學動物實驗中心，并在該校實驗室SPF級別動物房普通飼料喂養，自由飲水。

1.2 主要試劑及設備儀器 沙利度胺（批號：20030302，規格：25mg/片）購自江蘇常州制藥廠，小鼠抗人血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）單克隆抗體（批號：1467P306）和即用型細胞免疫組化（SABC法）試劑盒（批號：SA1022）購自北京中山生物技術工程公司，電子數顯卡尺購自成都成量工具有限公司（精確度0.01mm），電子天平（FA2004型）購自美國Chem Focus公司。

1.3 模型建立與實驗分組 收集處于對數生長期的Hela細胞，稀釋至1×107/ml；無菌條件下將0.2ml Hela細胞懸濁液接種于所有BALB/c裸鼠。1周后測得所有裸鼠均已成瘤，且移植瘤的直徑達到8mm。采用隨機數字表法將20只小鼠分為對照組、沙利度胺組、單純放療組（20Gy組）和沙利度胺聯合放療組（沙利度胺+20Gy組）4組，每組5只。對照組：腹腔注射0.2ml 0.5%羧甲基纖維鈉，1次/d，連續14d；沙利度胺組：沙利度胺用0.9%氯化鈉注射液配成25mg/ml，腹腔注射0.2ml沙利度胺溶液，1次/d，連續14d；20Gy組：照射時小鼠處于麻醉狀態（用5%水合氯醛，按0.005ml/g腹腔注射，麻醉成功后，將其捆綁固定），用6MVX線照射，按常規放療，2Gy/d，5次/周，共10次；照射部位為裸鼠腋部移植瘤瘤體，其余部位用鉛屏蔽處理；沙利度胺+20Gy組：腹腔注射0.2ml沙利度胺溶液，1次/d，連續14d；放療措施同20Gy組。

1.4 腫瘤體積和抑瘤率測定 治療第1天開始用電子數顯卡尺測量腫瘤的最長徑（L）和最短徑（W），每2d測量 1 次，并計算移植瘤體積（V），V=L×W2×π/6，其中系數π/6≈0.52。治療后第14天頸椎脫臼處死動物，剝瘤稱重（g），計算抑瘤率，抑瘤率=（對照組平均瘤重－給藥組平均瘤重）/對照組平均瘤重×100%。取出皮下移植瘤，用10%甲醛固定后，制成石蠟切片備用。

1.5 移植瘤組織中VEGF的免疫組化檢測 移植瘤標本經固定、包埋、切片后，按免疫組化SABC法進行染色，檢測移植瘤組織中VEGF的表達。操作步驟嚴格按試劑說明書，PBS代替一抗作陰性對照。結果判斷標準：VEGF以胞膜或胞質出現棕黃色均勻顆粒的為陽性細胞。在400倍光鏡下隨機選取 10個視野，分別計數每個視野內的陽性細胞數，計算陽性細胞的百分比：＜10%為陰性（-），10%～33%為弱陽性（+），34%～66%為陽性（++）；＞66%為強陽性（+++）。

1.6 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4組裸鼠腫瘤體積比較 如圖1所示，以觀察時間作為橫軸、移植瘤體積作為縱軸，繪制移植瘤生長曲線。治療前各組宮頸癌Hela腫瘤體積比較差異無統計學意義（P＞0.05）。治療后14d對照組、沙利度胺組、20Gy組和沙利度胺+20Gy組腫瘤體積分別為（0.85±0.14）、（0.71±0.12）、（0.66±0.10）和（0.51±0.09）cm3。與對照組比較，沙利度胺組、20Gy組和沙利度胺+20Gy組腫瘤體積均明顯減小，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與沙利度胺組和20Gy組比較，沙利度胺+20Gy組腫瘤體積均明顯減小，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

圖1 4組移植瘤生長曲線比較

2.2 各組裸鼠瘤重和抑瘤率比較 治療后14d，與對照組比較，沙利度胺組、20Gy組和沙利度胺+20Gy組瘤重均明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與沙利度胺組和20Gy組比較，沙利度胺+20Gy組瘤重均明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與對照組比較，沙利度胺組、20Gy組和沙利度胺+20Gy組抑瘤率均明顯升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與沙利度胺組和20Gy組比較，沙利度胺+20Gy組抑瘤率均明顯升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表2。

2.3 各組裸鼠移植瘤組織中VEGF的表達情況比較對照組、沙利度胺組、20Gy組和沙利度胺+20Gy組裸鼠移植瘤組織中VEGF表達分別呈強陽性、陽性、陽性和弱陽性，后3組與對照組相比VEGF表達均下降，其中沙利度胺+20Gy組下降最明顯，見圖2。

表2 治療后14d各組裸鼠瘤重和抑瘤率比較

圖2 各組裸鼠移植瘤組織中VEGF的表達情況比較（a：對照組；b：沙利度胺組；c：20Gy組；d：沙利度胺+20Gy組；SABC法，×400）

3 討論

放療是多數實體瘤的主要治療手段，如何提高實體瘤的放療敏感性一直是放療生物學的重要課題。近年來興起的分子靶向治療不僅具有獨特的抗腫瘤作用，而且與傳統的放化療具有明顯的協同作用[5-6]。沙利度胺曾因嚴重的致畸作用而被禁用，但對其研究并未停止。近年研究發現，沙利度胺具有抗腫瘤作用，并可通過直接抑制VEGF表達，調節細胞遷移和黏附，抑制血管形成[7]。VEGF是最重要的促血管生成因子之一，其與腫瘤的發展及放療敏感性密切相關[8-9]。有研究表明VEGF在宮頸癌組織中高表達，且與腫瘤分期、轉移、預后有關[10]。國內外已有報道沙利度胺用于多種實體瘤的治療[11-14]。但沙利度胺與放療結合治療宮頸癌的研究較少報道。本研究通過建立人宮頸癌裸鼠移植瘤模型，觀察沙利度胺對宮頸癌的放療增敏作用，希望將抗血管生成藥物與放療結合起來治療宮頸癌以期獲得更好的療效。本研究顯示，沙利度胺組、20Gy組和沙利度胺+20Gy組腫瘤體積和瘤重均低于對照組，差異均有統計學意義；且與沙利度胺組、20Gy組相比，沙利度胺+20Gy組均明顯降低，差異均有統計學意義。此結果表明沙利度胺與放療都能抑制移植瘤生長，且沙利度胺夠增強裸鼠移植瘤細胞對放療的敏感性。免疫組化結果提示沙利度胺組、20Gy組VEGF表達呈陽性，而沙利度胺+20Gy組VEGF表達呈弱陽性，均低于對照組的強陽性。提示沙利度胺放療增敏作用可能與抑制VEGF的表達有關，并通過抑制VEGF的表達來增強其放療作用。

本研究證實了沙利度胺聯合放療能夠顯著提高Hela宮頸癌小鼠移植瘤的放療敏感性，其機制可能與降低腫瘤組織中VEGF的表達有關，為沙利度胺成為新型放療增敏藥及臨床治療宮頸癌提供了理論依據。