基于ITS2條形碼鑒定酸橙類中藥材

黃玉龍，李順祥，黃林芳

(1．哈爾濱商業大學 生命科學與環境科學研究中心，黑龍江 哈爾濱150076; 2.中國醫學科學院北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京100193；3.湖南中醫藥大學 藥學院，湖南 長沙 410208)

2015版《中國藥典》[1]記載枳殼是蕓香科酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培變種的未成熟干燥果實，枳實是蕓香科酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培變種或甜橙CitrussinensisOsbeck的干燥幼果。枳殼和枳實類[2]藥材是我國常見大宗藥材，但枳殼和枳實類中藥材來源極其混亂復雜，柑橘屬很多物種都做中藥材，甚至同一物種的不同部位都是中藥材。例如，橘核、橘葉、橘絡、橘皮和果實都是藥材。柑橘屬的不同物種可以作為不同藥材，有時也作同一藥材。不同基源、不同藥材的藥效不一樣，為制藥和臨床上準確使用枳實和枳殼類中藥材，需要準確區分柑橘屬的不同物種。另一方面，柑橘屬很多物種都是常見大宗水果。從基因水平鑒別不同物種，也為園林水果栽培時鑒定橘類種子種苗提供一種可靠的方法。枳殼和枳實區別僅在成熟度不同，是一體二用[3]的中藥材，藥理、藥效、所含有效成分大致相同，僅從肉眼或傳統方法鑒別鑒橘屬種子屬于哪個物種非常困難。本實驗從物種水平鑒定枳實和枳殼及其混偽品，且實驗材料為酸橙及其混偽品的種子，故在此對枳實與枳殼不區分，下文統稱酸橙。

DNA條形碼是載入2015版《中國藥典》的中藥材分子鑒定新方法。DNA條形碼可結合現在非常流行的二維碼技術[4]，以期實現方便、快捷、智能化鑒定。ITS2[5]是Internal transcribed spacer 2(內部轉錄間隔區2)的縮寫，為核糖體DNA 的5.8S rDNA 和 28SrDNA 之間的基因序列，是非編碼區基因。ITS2在物種或亞種水平有明顯的序列變異性，被選為分子進化系統研究的分子標志，ITS2 還有易擴增、多拷貝、序列短、兩端保守利于設計引物等優點。楊美青等[6]用Geneious對中藥材防己進行ITS2序列一級結構比對，用The ITS2 Datebase對中藥材防己進行ITS2序列二級結構預測并用4sale軟件進行二級結構比對，并運用ProfDistS軟件構建PNJ樹，以期用ITS2鑒定中藥材防己。由文獻[7]可知，植物源中藥以ITS2 為主序列、psbA-trnH[8]為輔序列，動物源中藥材以COI 為主、ITS2 為輔；可達到中藥材鑒定的簡單、迅速、精確的要求，判斷結果標準簡單明了。

基于此，本實驗對正品枳(酸橙)[9]CitrusaurantiumL.及其5 種常見混偽品種甜橙CitrussinensisOsbeck、枸橘PoncirustrifoldiateL.、香櫞CitruswilsoniiTanaka、枸櫞CitrusmedicaL.、青皮CitrusreticulateBlanco進行ITS2分析，以期從基因層面鑒定區分蕓香科的這6個物種。

1 儀器與試劑材料

1.1 儀器

電熱恒溫水浴鍋(DK-S24，上海森信實驗儀器有限公司，中國)；球磨儀(Retsch MM400,Germany)；PCR儀(ABI-9700，美國)；常溫高速離心機(Sigma-1-14，德國)；電泳儀(DYY-8C，中國)；凝膠成像處理系統(BIO-RAD，美國)，測序儀(ABI3730XL型，Applied Biosystems Co.,USA)。

1.2 試劑材料

百泰克植物基因組DNA提取試劑盒(Bioteke Co.，China)；2×Taq PCR Master Mix(艾德萊,中國)；引物(生工 生物工程股份有限公司，上海)：正向為ITS2F:5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’,反向為ITS3R:5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’；DNA Marker(北京艾德萊生物科技有限公司，中國)；其余試劑均為分析純。

研究材料包括6個物種共43份樣品，其中包括自提樣品DNA序列8份，取自原植物種子樣品、GenBank中下載的序列35份；其中實驗樣本分為基原植物樣本、對照藥材樣本、藥材樣本、復核樣本。樣本信息詳見表1，自提樣品均經北京協和醫學院藥用植物研究所林余霖研究員鑒定。對照藥材樣本(樣本號:Y15031-1; JUHE0009),復核樣本由北京協和醫學院藥用植物研究所(樣本號: JUHE0008)進行復核驗證。

2 方法

2.1 總DNA 的提取

選取硅膠干燥的葉片及粒大飽滿種子，用酒精棉擦拭樣品表面，并用潔凈濾紙包好后適當敲碎，稱取約40 mg。每份樣品分別裝入已編號的2 ml EP管并給每份加入無菌鋼珠2枚和約3%的PVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)(該步操作應注意避免交叉污染)。經球磨儀以1 800 r/min速度研磨2 min，充分磨碎后，用700 μL預加入0.2%巰基乙醇的核分離液洗滌1～3次。使用百泰克植物基因DNA 提取試劑盒(離心柱型)提取總DNA，其余步驟均按試劑盒說明書操作。

2.2 PCR 擴增及產物測序

PCR反應體系為25 μL：包括2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL(2.5 μmol/ L)，模板DNA 2 μL，正、反向引物各1 μL，加RNase-free 水(8.5 μL) 補足至25 μL。擴增程序參考Chen等[5]的研究：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s;56 ℃、30 s;72 ℃、45 s(35個循環)；72 ℃、10 min。凝膠電泳檢查PCR產物情況。PCR擴增產物經純化后由中國農業科學院開放實驗室進行雙向測序。

表1 樣品來源
Tab.1 Source of samples

樣品拉丁學名樣本類別 樣本編號/GenBank 登錄號酸橙C.aurantium藥材樣本AB456125#、AB456126#、KU174590#、KU174591#、KU174592#、KU535472#、KX675070#、GQ225855#、JQ990184#。甜橙C.sinensis藥材樣本對照藥材AB456120#,Y15031-1?。枸橘Poncirus trifoldiate藥材樣本復核樣本GQ434823#、MF095889#、MF349106#,JUHE0003?。香櫞C.wilsonii基原植物藥材樣本復核樣本對照藥材JUHE0001?、JUHE0004?,JUHE0005?、JUHE0006?,JUHE0008?,JUHE0009?。枸櫞C.medica藥材樣本FJ641962#、FJ641965#、FJ641967#、FJ641968#、FJ641969#、GQ434821#、GQ434836#、GQ434837#、JF421486#、KT285089#、KT285090#、KT285091#、GQ225850#。青皮C.reticulate藥材樣本KT898272#、KX270874#、KX270876#、KX270877#、KX270879#、KX270880#、KX270881#、KX270906#、KX270907#、KX675072#。

注：*來源于藥用植物研究所的樣本為“種子種苗”項目中取自各道地藥材產區；#來源自Genbank下載序列

2.3 數據處理

運用CodonCode Aligner V 5.1.5對測序所得峰圖處理：去除引物端和低質量區段，并進行校對拼接，標準為無連續2個堿基質量低于20；全部序列用ITS2數據庫網站(http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/)基于隱馬爾可夫模型 (Hidden Markov model) 去除5.8S rRNA和28S rRNA區段獲得ITS2序列[10]，以及預測ITS2序列的二級結構。使用MEGA 6.0軟件進行比對、變異位點分析、計算遺傳距離(K2P)，并利用鄰接法((Neighbor-Joining))構建系統鄰接(NJ)樹；利用DNAstar 7.10軟件計算序列G+C含量；應用中藥材DNA條形碼鑒定系統(http://www.tcmbarcode.cn)鑒定各物種序列。

3 結果與分析

3.1 基于ITS2序列的物種鑒定分析

橘核共8個樣本的ITS2 序列經PCR擴增。瓊脂糖凝膠電泳檢測ITS2 序列的擴增情況，擴增成功率為100%。測序返回數據表明，測序成功率也為100%。對測序所得峰圖校對拼接處理后，全部序列的堿基質量值幾乎均大于20，經ITS2數據庫網站基于隱馬爾可夫模型去除5.8S rRNA和28S rRNA區段注釋并獲得ITS2序列，應用中藥材DNA條形碼鑒定系統對ITS2序列進行物種鑒定，確定樣本堿基ITS2序列確實為所需鑒定的目標物種。并且依據鑒定結果中樣本序列與鑒定所得物種序列的相似性(%)、E值、分值等情況分為不同單倍型。

鑒定結果表明，單倍型(A1、A2、A3、)、B、C、D、(E1、E2)和F分別為酸橙、甜橙、枸橘、香櫞、枸櫞和青皮正品基原物種。

3.2 種內、種間變異分析

采用MEGA 6.0軟件對序列進行比對、變異位點分析以及計算遺傳距離。種內變異位點情況：酸橙JQ900184的154和155位C-T互換，枸櫞GQ225850的189位T-G互換，甜橙、枸橘、香櫞和青皮無種內變異位點。酸橙與其混偽品種間變異位點范圍為6～72均比種內變異位點(0～2)多。酸橙及其混偽品的種內K2P距離范圍為0～0.009 1，酸橙與其混偽品的種間K2P最小距離范圍為0.016 9～0.354 7，所有樣本物種種內最大遺傳距離均小于他們與枳殼的最小遺傳距離。酸橙與其混偽品的遺傳距離區分度好，具體結果如圖1所示。利用軟件DNAstar 7.10進行序列長度統計并計算G+C含量，酸橙及其混偽品43個樣本的ITS2序列長度范圍為231～279 bp。所有序列長度都適中，都符合ITS2序列的一般長度要求，而且酸橙和混偽品序列長度相近，這便于序列堿基的一一對應比對，所以實驗比對結果的準確性和可信度更高。G+C含量范圍為69.26%～72.93%。GC間有3個氫鍵，AT間只有2個氫鍵，GC含量較高，說明酸橙及其混偽品的ITS2序列種內保守性、化學穩定性和空間結構穩定性較高，說明酸橙及其混偽品的鑒定選ITS2序列具有可行性，具體結果詳見表2。

圖1 酸橙及其混偽品ITS2序列種內種間K2P距離計算結果與變異位點數目Fig.1 The calculation results of the Kimura 2-Parameter (K2P) distances and number of variable sites of the ITS2 of C.aurantium and its adulterants

表2 酸橙及其混偽品的ITS2序列長度及G+C含量
Tab.2 The sequence length and the G+C content of the ITS2 ofC.aurantiumand its adulterants

樣品序列長度/bp平均G+C含量/%酸橙23969.80甜橙23969.36枸橘25272.93香櫞23271.55枸櫞27969.68青皮23169.26

3.3 NJ樹聚類分析

基于全體樣本的ITS2序列構建NJ系統進化聚類樹，如圖2所示。由圖2可知，青皮聚為一支，在其外圍甜橙的2個序列聚為一支，再外圍的所有酸橙(枳)序列自聚成一支，更外圍的所有枸櫞序列也自聚為一支，最外層還有枸橘和香圓的序列分別各自聚成一支，由此可看出枸橘和香圓、青皮和甜橙的物種之間親緣關系較其他物種親近一些。

由NJ樹可明顯看出，雖然酸橙及其混偽品都屬于蕓香科的物種，它們之間具有一定的親緣關系，但仍可準確區分。若同時結合變異位點和K2P遺傳距離分析可發現酸橙及其混偽品基于ITS2序列可做準確鑒定。

圖2 構建的酸橙及其混偽品的NJ樹(基于ITS2序列)Fig.2 Dendrogram of C.aurantium and its adulterants constructed with ITS2 sequences using NJ method

3.4 酸橙及其混偽品ITS2序列二級結構的構建

構建酸橙及其混偽品部分樣本的ITS2序列二級結構如圖3所示。每個單倍型至多構建1個樣本的二級結構，并對序列二級結構情況進行討論如下，由圖可知，除圖1(a)有3個小中心環外，所有的樣本物種ITS2序列二級結構均為1個中心環(主環)接4個螺旋區(四臂)構成，圖1(a)和圖1(b)分別為酸橙[9]Citrusaurantium的A1和A3 2個單倍型的ITS2二級結構，這2個不同單倍型的二級結構有細微差別，如中心圈和右上臂。圖1(c)為枸櫞Citrusmedica的ITS2二級結構，它與酸橙的區別在于它左上臂上多一個小圈。圖1(d)為青皮Citrusreticulate的ITS2二級結構，它與酸橙的區別在于它有一個大中心圈。圖1(e)是甜橙Citrussinensis的ITS2二級結構，它與酸橙的區別也在于它有一個大中心圈，僅從圖中很難區分青皮和甜橙，但是由表4可知它倆的序列長度不同，分別為231和239。圖1(f)是枸橘Citrustrifoldiat的ITS2二級結構，它與酸橙的區別在于它的右上臂小圈較多。圖1(g)為香櫞Citruswilsonii的ITS2二級結構，它與酸橙的區別在于它的右下臂小圈較小。

綜上，酸橙與其混偽品樣本ITS2序列二級結構在中心環(主環)的數目、位置，環的大小，四個螺旋區(四臂)的長度，螺旋臂與主環角度這些方面有所不同，但似乎很難找出顯著區別；故酸橙與其混偽品的二級結構鑒別的方法有必要結合變異位點分析法、遺傳距離(K2P)法，構建系統鄰接(NJ)樹法，比較序列長度和G+C含量法，中藥材DNA條形碼鑒定系統法等方法，綜合鑒定。

圖3 酸橙及其混偽品的ITS2序列二級結構Fig.3 ITS2 secondary structure of Citrus aurantium L. and part of its adulterants

4 結束語

本文運用ITS2成功得到了酸橙、甜橙、枸橘、香櫞、枸櫞和青皮正品基原物種的正確匹配結果。變異位點數和遺傳距離法也可以有效區分各物種，NJ樹可直觀地以圖的形式表現出酸橙及其混偽品的區別，但是酸橙及其混偽品ITS2二級結構的區分度以肉眼不能區分。綜上，ITS2可有效鑒定酸橙及其混偽品。

因橘類變異多，所以現在的果農栽培用的樹苗大多為無性繁殖的嫁接苗，但是無性繁殖也有弊端，例如，樹齡是母體的延續，易衰老，易被刮風下雨折枝。而實生苗比較著名的只有湖南沅江和江西某地的少量成片實生苗古樹。如果ITS2推廣應用鑒定柑橘屬的種子種苗，那么今后育種可以采用種子種苗進行有性繁殖，從而避免無性繁殖樹齡老齡化退化等問題。

致謝：感謝中國醫學科學院藥用植物研究所姚輝研究員在實驗中以及文章寫作中提供的幫助與指導。