無精及嚴重少精癥患者Y染色體微缺失類型與不同分型下性激素水平差異分析

林 靜,梁權輝,朱嫦琳,李煒煊

(佛山市第一人民醫院檢驗科，廣東佛山 528000)

關于男性不育，世界衛生組織將其定義為夫婦同居1年以上且性生活期間未采取任何避孕措施，由男方因素所致的女性不孕[1]。影響男性不育的因素眾多，諸如性功能正常與否、輸精管是否暢通、精子優良程度均為引發該病癥的因素，以最后一個因素最為常見[2-3]。現有研究指出，遺傳缺陷為精子質量較差的重要誘因，而Y染色體微缺失在所有遺傳因素中占有重要的地位[4]。隨著以試管嬰兒、卵泡漿內單精子注射技術為代表的輔助生殖技術日臻成熟，對于基因缺陷引起的男性不育不再是一個不可解決的問題[5]，所以圍繞Y染色體微缺失展開的研究成為一個全新的熱點議題。本次研究圍繞無精及嚴重少精癥患者Y染色體微缺失類型與不同分型下性激素水平差異予以分析，探討Y染色體微缺失檢測在輔助生殖及治療中的運用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2017年1月至2018年5月收治的293例無精及嚴重少精癥患者為研究對象，在患者知情同意下實施Y染色體AZF檢測，依據檢測結果分為Y染色體微缺失組21例及Y染色體無微缺失組293例。Y染色體微缺失組患者年齡23～45歲，平均(30.14±6.26)歲；病程時間1.5～5年，平均(2.34±0.16)年；病癥類型：無精癥5例、嚴重少精癥16例。Y染色體無微缺失組患者年齡22～44歲，平均(29.20±5.24)歲；病程時間1.2～5年，平均(2.58±0.20)年；病癥類型：無精癥89例、嚴重少精癥183例，均自愿參與本研究并簽署知情同意書。納入標準：(1)根據世界衛生組織發布的《男性實驗室檢測手冊》，無精子癥患者符合連續2次精液分析并離心后在沉淀中均未發現精子；嚴重少精子癥患者符合連續2次精液分析結果為精子密度<5×106/mL；(2)染色體核型正常者。排除標準：(1)弱精子癥、精子無力癥、精子數正常性不育者；(2)生理性不育者；(3)其他病理原因導致的男性不育者。兩組無精及嚴重少精癥患者在年齡等一般資料上比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1Y染色體AZF檢測方法 紫色EDTA抗凝管采集患者外周靜脈血2 mL，操作流程：(1)提取外周血細胞基因組DNA。(2)實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)試劑配制。(3)PCR擴增。檢測方法PCR，采用熒光探針進行多重PCR擴增，具體檢測缺失位點為：AZFa(sY84，sY86)，AZFb(sY127，sY134)，AZFc(sY254，sY255)，AZFa，AZFb，AZFc為3個獨立的檢測區域，對應5種缺失模式，分別為AZFa，AZFb，AZFc，AZF(b+c)，AZF(a+b+c)，試劑盒由上海透景生命科技有限公司提供，所有步驟均嚴格按照試劑盒內說明書要求進行。使用的儀器設備為Applied Biosystems ABI 7500型定量PCR儀(Biolytic美國)，對4個通道熒光(FAM /VIC/ROX/Cy5)同時進行檢測。

1.2.2性激素水平檢測方法 黃色凝膠促凝管采集患者空腹靜脈血4 mL并以3 000 r/min離心15 min，收集血清后以電化學發光法進行性激素水平的測定，儀器設備為德國西門子拜耳公司生產的ADVIA Centaur XP全自動化學發光免疫分析儀，各指標生物參考區間:FSH 1.00～7.00(IU/L)，LH 1.00～8.00(IU/L)，T 9.10～46.20(mmol/L)。

1.3觀察指標 選取Y染色體微缺失位點和不同缺失模式以及性激素FSH、LH、T水平為觀察指標。

2 結 果

2.1無精及嚴重少精癥患者Y染色體微缺失位點和缺失模式構成 293例無精及嚴重少精癥患者中Y染色體微缺失21例(7.17%)，缺失類型包括AZFc缺失12例(57.14%)、AZFa缺失2例(9.52%)、AZF(b+c)缺失4例(19.05%)、AZF(a+b+c)缺失3例(14.29%)，AZFc區缺失率最高，次之AZFb，AZFa最低，差異有統計學意義(χ2=16.645，P<0.05)。見表1。

2.2Y染色體微缺失與性激素的關系

2.2.1兩組患者性激素水平比較 兩組FSH、LH、T相比較，Y染色體微缺失組FSH高于Y染色體無微缺失組，差異有統計學意義(P<0.05)，LH、T差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表1 Y染色體微缺失位點和缺失模式例數及頻率

表2 兩組患者性激素水平比較

2.2.2Y染色體微缺失組內不同分型患者性激素水平比較 Y染色體微缺失組內不同分型患者性激素水平相比較，FSH和LH水平由高至低均依次為，AZF(a+b+c)缺失、AZF(b+c)缺失、AZFa缺失、AZFc缺失，AZF(a+b+c)缺失模式水平升高最為顯著，差異有統計學意義(P<0.05)，T水平差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 Y染色體微缺失組內不同分型患者性激素 水平比較

3 討 論

根據流行病學調查，目前全球范圍內出現不育的育齡夫婦占比約為10%～15%，而在此其中約有半數是由男方因素所致[6-7]。既往臨床認為核型異常、內分泌功能紊亂、長期接觸環境毒物、生殖道病變、精索靜脈曲張、睪丸等因素是導致男性不育的主要原因，但隨著細胞遺傳學以及分子生物學內容的不斷拓展，位于Y染色體上的AZF基因日益引起醫學界的重視與關注[8]。該基因一旦存在缺失情形，勢必會給男性生育帶來嚴重不利影響，引發無精或嚴重少精[9]。盡管當前研究已經一致證實Y染色體微缺失為男性不育的重要誘因，但是關于具體的缺失機制卻并未形成一致共識，絕大多數學者認為Y染色體獨特的單倍體結構是導致AZF缺失的主要原因[10]。理由如下：由于Y染色體為單倍體結構，自身不具有DNA修復能力，男性精子生成過程中胚細胞分裂尤為迅速，導致其與卵子結合時突變的風險更高，一旦某一個區域缺失就會給整個Y染色體帶來不利影響[11]。故Y染色體微缺失檢測能夠幫助臨床確診無精或嚴重少精癥患者的根本病因，目前已經在歐美發達國家中成為常規的不孕檢測項目[12]。

AZFa、AZFb、AZFc為3個獨立的檢測區域，KRAUSZ等[13]研究表明AZFc區域的缺失率發生最高，其次是AZFb，AZFa的檢出率最低，據此該學者指出男性不育患者Y染色體AZF區微缺失是導致其不育的主要原因且關系十分緊密。本次研究通過對293例無精及嚴重少精癥患者Y染色體AZF進行檢測，結果發現Y染色體微缺失21例(7.17%)，AZFc缺失12例(57.14%)、AZFa缺失2例(9.52%)、AZF(b+c)缺失4例(19.05%)、AZF(a+b+c)缺失3例(14.29%)，AZFc區缺失率最高，次之AZFb，AZFa最低，與現有研究成果基本吻合，均一致證實AZFc區域為Y染色體微缺失的主要類型以及熱點缺失區域，但本文研究發現b位點單獨缺失模式少見，常見聯合a位點或者c位點出現聯合缺失，其發生機制有待進一步研究。此外，本文研究證實，Y染色體微缺失組FSH顯著高于Y染色體無微缺失組，差異有統計學意義(P<0.05)，而LH、T差異無統計學意義(P>0.05)，表明Y染色體微缺失將會導致患者生精能力下降，即便是生出的精子也并未發育成熟，使得下丘腦-垂體-性腺軸無法正常運轉，能夠抑制FSH的抑制素分泌嚴重不足，造成了FSH濃度的升高[14]。Y染色體微缺失組內不同分型的無精及嚴重少精癥患者性激素水平相比較，AZF(a+b+c)缺失模式者FSH、LH水平顯著高于其他缺失模式，差異有統計學意義(P<0.05)，T差異無統計學意義(P>0.05)，提示不同AZF缺失分型與性激素中FSH、LH存在著密切的關聯性。AZFa區域的缺失者通常表現為支持細胞綜合征(SCOS)，為絕對的無精子癥，供精成為其唯一選擇，AZFb區域缺失者表現為生精阻滯，精子生成被阻滯在精母細胞階段，睪丸內幾乎沒有成熟精子形成，而AZFc區域缺失者尚存精子生成能力，但隨著FSH的升高，精子數目呈進行性下降趨勢，所以必須予以及早干預治療或無創取精后冷凍保存[15]。

4 結 論

無精及嚴重少精癥患者Y染色體微缺失位點以AZFc區域缺失為主、AZFb缺失次之、AZFa缺失少見；所形成的5種缺失模式中，又以AZFb單獨缺失模式最為少見，常聯合a位點或者c位點出現共同缺失。FSH水平在Y染色體微缺失患者中顯著升高，其中AZF(a+b+c)缺失模式的FSH水平升高最為顯著，通過檢測Y染色體有無缺失可為輔助生殖及治療提供強有力的幫助。