1例α2珠蛋白新突變型分析

郭薇霞,唐 健,何建萍,羅勝軍,黃 鎧,林克勤,褚嘉祐,楊昭慶△

(1.中國醫學科學院&北京協和醫學院醫學生物學研究所遺傳室,云南昆明 650118;2.昆明市婦幼保健院遺傳室，云南昆明 650031)

異常血紅蛋白是由于珠蛋白基因突變導致珠蛋白分子結構和功能異常的一類血紅蛋白，當產生臨床表現時稱為異常血紅蛋白病[1]。異常血紅蛋白的種類和分布頻率存在地域和人種差異[2]，根據人類血紅蛋白變異體數據庫HbVar(http://globin.bx.psu.edu/hbvar/menu.html)結果顯示，目前全世界報道的發生在α珠蛋白肽鏈上的異常血紅蛋白超過490種，我國報道的有38種。大多數異常血紅蛋白是由于珠蛋白鏈上單個堿基替換引起的，不產生臨床癥狀，因此需要借助血紅蛋白電泳和基因檢測才能確診[3]。本研究通過對血紅蛋白電泳結果異常的1例樣本進行了基因診斷，檢出了1例α珠蛋白基因新突變型，現報道如下。

1 資料與方法

1.1研究對象 先證者：女，26歲,就診于云南省昆明市婦幼保健院。由于無法聯系到這患者及其家屬，未采集到家系其他成員血樣。

1.2方法

1.2.1血液學檢查 取靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸鉀(EDTA-K2)抗凝后，采用血細胞分析儀日本sysmex XT-2000i檢測紅細胞數量、血紅蛋白含量(Hb)、平均紅細胞體積(MCV)和平均血紅蛋白含量(MCH)等血常規指標。采用歐洲helena V8全自動毛細管電泳儀進行血紅蛋白電泳檢測。

1.2.2常見地貧突變基因檢測 采用PCR-反向點雜交法檢測23種中國人常見的地中海貧血基因型(SEA、-α3.7、-α4.2、αCSα、αQSα、αWSα、41-42M、654M、-28M、71-72M、17M、βEM、IVS-I-1M、IVS-I-5M、27/28M、43M、-29M、-30M、31M、-32M、14-15M、IntM和CAPM)。所用試劑為亞能生物技術(深圳)有限公司提供的地中海貧血基因檢測試劑盒。

1.2.3α和β珠蛋白基因片段擴增 采用Axygen公司的AxyPrep血基因組DNA小量制備試劑盒，嚴格按照說明書操作提取全血DNA。根據NCBI中α、β珠蛋白基因序列設計引物擴增包括轉錄啟動子序列及3個外顯子在內α、β珠蛋白基因序列。引物序列如表1所示，由昆明碩擎生物技術有限公司合成。PCR擴增采用大連寶生物公司的TaKaRa LA Taq酶，儀器使用美國ABI公司的9700 PCR擴增儀。β基因、α1基因、α2基因PCR擴增體系均為30 μL:每一反應體系含2×GC Mix Buffer 15 μL、上下游引物各0.3 μL、LA Taq 0.2 μL、H2O 11.2 μL、DNA模板含量約100 ng。反應條件為：94 ℃ 4 min，94 ℃ 45 s，64 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，共35個循環，72 ℃延伸20 min。

1.2.4α和β珠蛋白基因片段測序 純化PCR產物后，送昆明碩擎生物技術有限公司進行測序，見表1。

表1 α、β珠蛋白基因擴增引物

續表1 α、β珠蛋白基因擴增引物

2 結 果

2.1血常規結果 先證者血常規結果為：RBC 4.61×1012、Hb 143 g/L、MCV 92.4 fL、MCH 31 pg，為正細胞正色素，無明顯異常。

2.2血紅蛋白毛細管電泳結果 先證者HbA占總血紅蛋白含量為76.35%、血紅蛋白A2(HbA2)為1.42%、血紅蛋白(HbF)含量異常升高，達到了18.56%，產生一個未命名的未知條帶，含量為3.10%，如圖1所示。

2.3基因型檢測結果 先證者檢出HbA2基因第27位密碼子GAG>CAG，Glu>Gln雜合突變，采用人類基因組變異協會(HGVS)命名規則命名為HBA2:c.82G>C(圖2)，未檢出α、β地貧基因突變。

注：產生與HbF未完全分離的未知異常條帶

圖1HbMile血紅蛋白電泳圖

注：α珠蛋白基因第27位密碼子GAG>CAG雜合突變，箭頭表示突變

圖2HbMile測序圖

3 討 論

我國異常血紅蛋白的發生率和分布存在明顯遺傳多態性，2003年全國各地區異常血紅蛋白發生率普查結果顯示云南異常血紅蛋白發生率最高，達到了5.93%[4]。目前云南報道較多、最常見的異常血紅蛋白為HbE[5]，也有一些罕見異常血紅蛋白如Hb Rush的報道[6]。而本研究此次檢出的Hb Mile為世界范圍內首次報道。

該突變攜帶者是26歲女性在進行地中海貧血產前篩查時，常見地貧基因檢測結果都為陰性，但是血紅蛋白電泳檢查結果卻較為罕見與復雜。經過復查后發現該突變產生的未知異常血紅蛋白條帶與F帶利用等點聚焦毛細管電泳技術不能完全分開，在電泳結果圖上表現為F帶與異常條帶波谷融合，此時檢測到的F帶含量為18.56%，是HbF和部分異常條帶含量的總和。為了進一步明確異常血紅蛋白條帶產生的原因所以進行了血紅蛋白基因測序檢查，最終檢出α珠蛋白基因HBA2第27位密碼子GAG>CAG雜合突變。

本研究檢出的Hb Mile是由于α2珠蛋白基因第27位密碼子GAG>CAG雜合突變(HGVS命名HBA2:c.82G>C),導致該位置上的谷氨酸(Glu)被替換為谷氨酰胺(Gln)，該突變先前未見相關報道，這是首次報道，并以先證者的籍貫地云南彌勒命名。蛋白質三維結構分析顯示該突變位于α珠蛋白的保守區域，與β珠蛋白交聯的位點[7]。盡管該G>C突變從未報道過，但是該位置上報道過其他突變類型Hb Shuangfeng (HBA2 or HBA1:c.82G>A)，這一突變在一中國漢族家系中發現，它是第27位密碼子谷氨酸被賴氨酸替代，產生含量為13%的不穩定異常血紅蛋白，雜合子個體即產生了溶血性貧血的臨床癥狀[8]。提示這一位點在維持血紅蛋白穩定性方面發揮重要作用，但是本研究中Hb Mile先證者血液學參數正常，推測可能是由于替換的氨基酸Gln與原來的Glu性質相似，所以突變后對血紅蛋白的功能影響較小，攜帶者不產生臨床表現。

由于大多數異常血紅蛋白不產生臨床表現，所以只通過血常規指標難以有效篩查血紅蛋白病，而毛細管電泳具有更高的分辨率和準確性，目前已經成為實驗室診斷血紅蛋白病的重要手段之一[9]。但是由于異常血紅蛋白具有異質性，同一電泳區帶可能是由多種突變造成[10]，而本研究中則出現了利用毛細管電泳技術也不能將異常條帶與F帶完全分離的罕見狀況。若能重新采集患者及家系成員血樣，可以考慮使用分辨率較高的高效液相色譜法對異常血紅蛋白含量進行檢測。因此將血紅蛋白電泳和基因診斷相結合，才有利于檢出更多的異常血紅蛋白突變型，基因檢測結果能指導電泳結果進行正確解讀。

4 結 論

本研究首次報道了α珠蛋白基因突變型Hb Mile(HBA2:c.82G>C，CD27:Glu>Gln)，豐富了我國和人類血紅蛋白突變譜。通過對表型進行初步分析，該突變不產生明顯臨床癥狀，但是由于云南是地中海貧血和異常血紅蛋白病高發區，異常血紅蛋白突變有較大概率產生復合雜合子，因此其臨床危害性和人群發生率有待于繼續研究。