保存溫度及時間對化學發光法測定直接腎素濃度的影響

鄧玲艷，王 旭，李輝軍

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院檢驗科，湖北武漢 430030)

原發性醛固酮增多癥(PA)，簡稱原醛癥，是指腎上腺皮質病變分泌過多的醛固酮，導致體內潴鈉排鉀，血容量增多，以及腎素-血管緊張素系統受抑制，以血漿高醛固酮和低腎素水平為主要特征，臨床癥狀表現為高血壓伴有(或不伴有)低血鉀的綜合征[1]，是繼發性高血壓的主要病因之一，約占難治性高血壓的10%左右[2]。研究表明，高血壓人群中采用血漿醛固酮與血漿腎素比值(ARR)篩查后，原醛癥檢出率提高了10倍左右[3]。美國《原發性醛固酮增多癥患者診斷治療指南》[1]和中國《原發性醛固酮增多癥診治專家共識》[4]均推薦ARR作為原醛癥的首選篩查指標。

由于原醛癥患者腎素水平低，且腎素是ARR的分母，故腎素測定的準確性在很大程度上決定了ARR結果的準確性。腎素測定的傳統方法是放射免疫法，其原理是根據腎素可將血管緊張素原轉化成血管緊張素I，通過測定血管緊張素I的生成速率來間接反映血漿腎素活性(PRA)。近年來，全自動化學發光法測定血漿直接腎素濃度(DRC)，由于其操作相對放射免疫法測定PRA受影響因素更少、操作更簡易、更易于標準化且無放射性污染，逐漸應用于臨床[5-6]。

樣本穩定性是影響檢測結果準確性的一個重要因素。研究表明溫度不僅影響PRA[7]，也會影響DRC[8-11]。因為不同實驗室DRC穩定性結果并不完全相同[8-11]，所以本研究的目的是調查本實驗室血漿中DRC在不同存儲溫度下的穩定性，為日常工作提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 隨機選擇健康體檢者65例，男35例，女30例，年齡22～56歲，肝腎功能正常，影像學檢查顯示心臟、肺、肝、脾、腎及腎上腺、子宮及附件、前列腺等重要臟器未見明顯異常，未服用任何影響腎素-醛固酮系統的藥物[1]。

1.2儀器與試劑 血漿直接腎素濃度在意大利索靈化學發光免疫分析系統 (儀器型號：LIAISON XL) 上進行檢測，嚴格按試劑說明書進行操作。

1.3方法 采用伯樂內分泌質控品進行嚴格的質量控制，批號40311，累積均值73.9 μIU/mL,CV為3.65%；批號40313，累積均值107.3 μIU/mL，CV4.19%，均值累積時間超過3個月。自制混合血漿，按CLSI文件EP5-A2 驗證精密度，濃度14.4 μIU/mL 批內不精密度CV1.0%,總不精密度 3.3%；濃度42.2 μIU/mL 批內不精密度CV2.2%,總不精密度 3.0%。

采用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝真空采血管(BD,美國)于上午7:30-8:30采集空腹靜脈血6 mL(立位)，上下顛倒混勻，室溫離心(3 000×g，10 min)分離血漿并分裝(30 min內完成)，排除嚴重脂血、溶血、黃疸以及血樣體積不足的樣本。新鮮樣本立即上機檢測作為即刻值(基線水平)，其他樣本按以下方案儲存。

室溫穩定性：20支樣本，每支分成5等份，分別在室溫(25 ℃)放置0、2、4、6、8 h后檢測；冷藏穩定性：20支樣本，每支分成5等份，分別冷藏(4 ℃)0、2、4、6、8 h后檢測；冷凍穩定性：20支樣本(由于操作失誤，最終只有17支樣本檢測值納入計算)每支分成4等份，除新鮮樣本外，分別保存在-20 ℃條件下4、8、12周后在37 ℃水浴中快速解凍，并立即檢測；凍融穩定性：5支樣本，每支分成4等份，新鮮樣本立即檢測作為基線值，其他3組樣本立即凍存于-20 ℃。 第2天,第4組樣本在37 ℃水浴中快速解凍，隨后再凍存于-20 ℃(解凍-凍存在5 min內完成)；第3天同一時間，第3組、第4組樣本重復相同操作；第4天同一時間，3組樣本在37 ℃水浴中快速解凍，并立即上機檢測。這樣，第2組、第3組、第4組樣本分別凍融1次、2次、3次。

2 結 果

2.1受試者的一般資料比較 本研究一共選擇65例受試者，按照其血壓，分成理想血壓組(收縮壓：90～120 mm Hg、舒張壓：60～80 mm Hg)42例；以及正常血壓高值組(收縮壓：>120 mm Hg～<140 mm Hg、舒張壓：>80 mm Hg～<90 mm Hg)23例。正常血壓高值組與理想血壓組在收縮壓、舒張壓、體質量指數(BMI)、血清鈉離子濃度、血清肌酐、腎小球濾過率(eGFR)的差異有統計學意義(P<0.05)，而DRC、年齡、血清K+濃度在這兩組的差異無統計學意義(見表1)。

表1 受試者一般資料

2.2計算DRC差異率可接受標準 查閱文獻，DRC在健康人中CVb為30.1%[14]。CVa來源于本實驗室質控累積不精密度和驗證不精密度：3.3%、3.0%、3.65%、4.19%，計算TCL分別為17.6%、17.2%、18.1%、19.0%。本實驗以17%作為腎素濃度差異率可接受標準。

2.3DRC在室溫條件下的穩定性 在室溫條件下，DRC隨放置時間的延長有降低趨勢，詳見表2。盡管從放置在室溫2 h起，DRC檢測值與即刻值相比，差異具有統計學意義(P<0.05)，但是放置2 h和放置4 h所有樣本DRC的差異率均在17%以內。當室溫放置6 h，20例樣本中僅有1例DRC測定值從3.63 μIU/mL降至2.79 μIU/mL，差異率為-23.2%。故樣本采集后，室溫放置6 h內檢測，絕大多數DRC降低幅度臨床可接受。

表2 室溫條件下血漿直接腎素穩定性

注：差異率>17%認為差異臨床不可接受；-表示無數據

2.4DRC在冷藏條件下的穩定性 冷藏條件下，DRC隨放置時間延長有升高趨勢，見表3。研究發現，從冷藏2 h開始，DRC檢測值與即刻值相比，差異具有統計學意義(P<0.05)，而直到冷藏4 h開始，有2個樣本的差異率超過了TCL(分別為2.48 μIU/mL升高至2.94 μIU/mL，差異率18.6%，19.02 μIU/mL升高至25.14 μIU/mL，差異率32.2%)，并且隨冷藏時間延長，差異率超過TCL的比例逐漸增多。

表3 冷藏條件下血漿直接腎素穩定性

注：差異率>17%認為差異臨床不可接受；-表示無數據

2.5DRC在冷凍條件下的穩定性 研究DRC在冷凍條件下的穩定性之前，先觀察DRC的凍融穩定性。凍融可使DRC降低，并且隨著凍融次數增加，DRC檢測值逐漸降低，見表4。當分離后的血漿樣本保存在-20 ℃條件下12周時，DRC的降低幅度臨床可接受，見表5。

表4 血漿直接腎素凍融穩定性

表5 冷凍條件下血漿直接腎素穩定性

注：差異率>17%認為差異臨床不可接受；-表示無數據

3 討 論

腎素由腎小球旁細胞合成，或由腎素原在一定條件下轉化生成[15]。腎素原是腎素的前體，在血漿中以兩種構象存在，一種是無活性形式，其活性位點被它N段的一個多肽片段封閉，大概占總量的98%；另一種是活性形式，雖然也含有prosegment，但活性位點未被封閉，這種有活性的含量非常少，不到2%，故健康者外周血中，腎素原的活性非常低。但在低溫(-5 ℃～4 ℃)條件下，無活性腎素原的prosegment可以打開，變成有活性的形式，這一過程被稱為腎素原的冷激活[15]。由于血漿中的腎素原濃度約為腎素的10倍,在腎素分泌受抑制的患者(如原醛癥患者)體內，腎素原的濃度可較腎素濃度高100倍[15]，所以少量腎素原激活都會使腎素濃度檢測產生較大影響。

基于腎素原上述特性，當血液樣本置于低溫環境時，腎素原被冷激活轉換為活性腎素，從而影響腎素測定值的準確性。然而，若樣本放置在室溫時間過長，腎素也可能由于氧化、變性和構象變化等原因導致濃度降低。相關指南和共識[1,4]建議，用于腎素檢測的樣本，從采集、轉運到分離血漿的時間不宜超過30 min，這在日常工作中往往難以做到，尤其當需要將樣本轉運至第三方機構檢測時。本研究表明，腎素不穩定，直接腎素離體后，不管是保存在室溫還是冷藏條件下，短時間(2 h)內的變化差異有統計學意義。進一步分析表明，血漿放置在室溫6 h及冷藏2 h時，DRC變化幅度可接受。由于樣本冷藏運輸較常溫運輸繁瑣，因此樣本宜保存在室溫并在采集后的6 h內送到實驗室。當分離出的血漿樣本冷凍(-20 ℃)12周時，直接腎素的變化幅度可接受，這與李溪月等[11]的建議一致。此外，本實驗首次研究直接腎素的凍融穩定性，發現凍融會使DRC降低，僅能凍融一次。

查閱文獻，在相同的檢測系統，GRUSON等[8]發現DRC放置在室溫有下降趨勢，6 h差異開始有統計學意義，他們建議樣本采集后6 h內送檢，與本文的建議相同；GLINICKI等[9]研究表明在樣本采集后20～30 min內，DRC在室溫條件下變化不顯著；LOCSEI等[10]發現當樣本放置在室溫2 h時，DRC顯著降低，但在0℃～5℃條件下2 h，DRC變化不顯著。李溪月等[11]發現室溫放置6 h，冷藏3 h，DRC的差異均有統計學意義。本研究結果顯示，在冷凍或冷藏2 h后，與基線值比，DRC的均值差異均有統計學意義。幾個實驗室對均值統計的結果的不一樣，可能與人種不同，實驗室環境不同等因素有關。但是，上述其他國內外的研究在數據分析時，僅對血漿DRC的均值做了χ2分析或t檢驗，都未將檢測系統的分析變異和個體內生物學變異考慮在內，這可能是導致本次研究結果和其他研究結果不完全相同的主要原因。

在臨床上，由于血漿腎素與醛固酮一起，主要用于原醛癥的篩查及原發性高血壓的病因分析，而正常血壓高值往往認為是原發性高血壓的前期。因此，在本研究中，筆者對納入的健康人群進行了理想血壓和正常血壓高值的分組，發現DRC在兩組中差異無統計學意義。然而，血漿中DRC被抑制是原醛癥的特征之一，不同貯存條件是否會影響原醛癥的篩查效率，有待進一步的研究。此外，本研究驗證另外一個有趣的現象，即在健康體檢者中，DRC明顯異于說明書推薦的參考區間(立位：4.4～46.1 mIU/L)，可能與種族不同有關[16]。

4 結 論

本實驗研究顯示，外周血中腎素濃度不穩定。在室溫條件下，隨保存時間延長降低；在冷藏條件下，隨保存時間延長升高；本實驗首次研究DRC凍融穩定性，DRC隨凍融次數增加而降低。因此，樣本采集后應在6 h內送檢并檢測，若來不及檢測，可凍存于-20 ℃至少12周，應避免反復凍融。