RNA干擾USE1基因慢病毒載體的構建及鑒定

王佳悅 劉香男 彭康莉 趙博

（上海交通大學藥學院，上海 200240）

泛素化是真核生物體內重要的蛋白翻譯后修飾機制，泛素經泛素活化酶E1活化后，在泛素結合酶E2和泛素連接酶E3的級聯作用下傳遞至底物蛋白，決定底物蛋白的命運［1］。之前人們認為真核生物體內僅存在一種泛素活化酶Uba1（又稱 Ube1）［2-3］，2007年有三篇文章接連報道發現了第二個泛素活化酶Uba6［4-6］，兩種泛素活化酶E1在將泛素傳遞至各種不同的泛素結合酶E2時雖有所重疊，但也各具有不同的活性［4］。真核生物體內存在近40個E2和600多個E3［7-8］，每個E2可與多個E3反應每個E3可識別多個底物蛋白進行泛素化修飾；多個E2也可與同一個E3反應，不同的E2-E3配對可將不同長度和不同拓撲結構的泛素鏈傳遞至底物蛋白上，形成錯綜復雜的泛素傳遞網進而修飾胞內蛋白［9］。

鑒于泛素化過程中E1-E2-E3的交叉反應性，目前很難針對某一條特異性的泛素化通路，對其E2-E3間及E3-底物蛋白間的相互作用進行研究，且對于后發現的泛素活化酶Uba6的功能研究仍不夠深入。為探究Uba6泛素活化酶介導的泛素化通路，我們已通過正交泛素轉移的方法，對比探索了泛素活化酶Uba1與Uba6在哺乳動物細胞中分別對應的泛素化過程，找到了494個在Uba1介導的泛素化通路中對應的底物蛋白，528個在Uba6介導的泛素化通路中對應的底物蛋白及225個二者的共同底物［10］。盡管Uba6與Uba1有著共同作用的泛素結合酶E2，但泛素結合酶USE1被證明是Uba6的特異性E2，與Uba1無交叉反應活性［3］，且近期有研究表明，USE1在肺癌細胞中存在過表達現象，可能與肺癌細胞的形成、轉移、擴散相關，可作為肺癌發生的生物標記［11］。為進一步探究Uba6-USE1這條特異性泛素化通路的功能，我們在前期研究的基礎上，通過RNA干擾技術構建靶向USE1基因的慢病毒載體，包裝感染HEK-293細胞，抑制細胞中USE1基因的表達，后期將與過表達USE1基因、正常表達USE1基因細胞株對比其細胞中Uba6-USE1泛素化過程，利用LC-MS液質聯用色譜及生物信息學方法找出3條USE1基因表達量不同的泛素化通路中的下游底物，旨為進一步研究Uba6-USE1特異性泛素化通路功能提供實驗依據，奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚腎HEK-293細胞購自中國科學院細胞庫，慢病毒抑制表達載體pLL3.7由上海交通大學藥學院孫磊惠贈；Gel/PCR純化試劑盒、質粒DNA小量抽提試劑盒購自Favorgen公司；限制性核酸內切酶BamH I，XhoI及其緩沖液、T4 DNA連接酶及其緩沖液、anti-USE1抗體購自Thermo Fisher公司；anti-GAPDH抗體購自上海優寧維生物科技股份有限公司；RNA反轉錄試劑盒購自東洋紡（上海）生物科技公司；大腸桿菌DH5α菌種購自天根生化科技（北京）有限公司；引物的合成及質粒的測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 shRNA的設計與合成 根據NCBI數據庫中USE1基因的mRNA序列（NM_023079），利用Invitrogen公司提供的BLOCK-iTTMRNAi Designer工具，設計靶向USE1基因的shRNA序列。選擇5'端以G開頭，GC值在35%-55%之間，且靶點序列起始位置不同的三條序列作為候選，如表1所示。根據慢病毒抑制表達載體pLL3.7的特點及要求，在寡核苷酸鏈最兩端加上BamH I和XhoI酶切位點，并在5'端加上重建U6啟動子的T堿基，在shRNA序列后加上Loop環序列TTCAAGAGA，在3'端加上終止序列TTTTTT。

表1 靶向USE1基因的RNA干擾序列

1.2.2 USE1慢病毒抑制表達載體的構建與鑒定 將合成好的寡核苷酸單鏈經退火后形成雙鏈，酶切保護堿基后與pLL3.7空載體經T4 DNA連接酶作用于16℃連接過夜，連接產物轉化至DH5α感受態細胞后，均勻涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB固體平板上，倒置于37℃恒溫培養箱過夜，次日挑取單克隆至含相同濃度氨芐青霉素的LB液體培養基中震蕩培養過夜，提取質粒，然后進行測序。

1.2.3 細胞的培養 凍存的HEK-293細胞經37℃水浴復蘇后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基中，在37℃、含5% CO2的培養箱中培養，定期觀察細胞狀態，根據細胞生長情況適時更換培養基，一般

2 d傳代一次。

1.2.4 慢病毒質粒共轉染HEK-293細胞及慢病毒的包裝 當HEK-293細胞融合度達70%-80%時準備轉染。將3種含不同干擾序列的pLL3.7-shRNA慢病毒重組質粒及作為陰性對照的pLL3.7慢病毒空載體分別與慢病毒包裝載體psPAX2、VSVG按照質量比1∶3∶4混合均勻，加入Opti-MEM培養基；另取相同體積的Opti-MEM培養基與轉染試劑PEI進行混合，室溫靜置5 min后，將分別含有質粒和轉染試劑的兩管Opti-MEM培養基混勻，室溫靜置20 min，更換細胞培養基為無血清的DMEM，將混合液加至細胞培養皿中，于37℃、含5%CO2的培養箱中培養6-8 h，更換培養基為完全培養基，繼續培養48 h，收集病毒上清液，離心濃縮，凍存于-80℃。

1.2.5 慢病毒滴度的測定及最佳稀釋倍數的確定 將HEK-293細胞按照每孔2×104個的密度鋪于96孔板，培養24 h后，用DMEM完全培養基將濃縮后的病毒上清按10倍遞減法依次稀釋，培養48 h后，于熒光顯微鏡下觀察病毒感染細胞狀況，確定最佳稀釋倍數，并按照以下公式計算病毒滴度。

病毒滴度（TU/mL）=熒光細胞數/相應稀釋倍數

1.2.6 實時定量PCR及Western Blot檢測基因表達量 病毒感染前一天，按照每孔5×104個的密度將HEK-293細胞鋪于24孔板，次日按照最佳稀釋倍數加入病毒稀釋液感染細胞，培養24 h后，棄病毒液，更換為DMEM完全培養基，繼續培養48 h，收集細胞提取總RNA，反轉錄為cDNA，以GAPDH為內參，通過實時定量PCR測定目的基因的表達量，其引物序列如下：

按照上述同樣的方法將HEK-293細胞鋪于24孔板并進行病毒感染并培養48 h后，每孔加入適量5×蛋白上樣緩沖液裂解細胞，收集裂解液并金屬浴加熱10 min使蛋白變性后進行SDS-PAGE電泳（分離膠濃度為10%），將蛋白條帶轉印至NC膜后，用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，洗去膜上殘留的牛奶，分別用anti-USE1抗體（1∶1 000稀釋）和anti-GAPDH抗體（1∶1 000稀釋）敷育，4℃過夜，次日用TNET緩沖液洗膜3次，洗去殘留在膜上的一抗，用相應的兔源二抗（1∶10 000稀釋）室溫敷育1 h，用TNET緩沖液洗膜3次后用Odyssey雙色紅外熒光成像系統掃膜觀察結果。

2 結果

2.1 三種USE1抑制表達慢病毒重組質粒pLL3.7-shRNA的鑒定

將構建好的質粒送去測序，結果表明插入序列與shRNA設計的目的基因片段完全一致，說明質粒構建成功，可以用于后續實驗。

2.2 USE1抑制表達慢病毒重組質粒包裝結果

USE1抑制表達慢病毒重組質粒pLL3.7-shRNA及包裝質粒共轉染至HEK-293細胞48 h后，于熒光顯微鏡（400×）下觀察，包裝結果如圖1所示。由于pLL3.7抑制表達載體可同時表達GFP綠色熒光蛋白，慢病毒包裝后的細胞在藍色熒光激發下在視野中呈現綠色，其中分圖AB、CD、EF和GH分別代表3種抑制表達重組質粒pLL3.7-shRNA1，2，3及陰性對照pLL3.7慢病毒空載體在同一視野下白光和熒光的包裝結果。結果表明，轉染48 h后，80%以上的HEK-293細胞均呈現較強綠色熒光，說明3種慢病毒質粒及pLL3.7慢病毒空載體均成功轉染至細胞中，即慢病毒包裝成功。

2.3 病毒滴度測定結果及最佳病毒上清稀釋倍數的確定

將收集的慢病毒上清經離心濃縮后，按照10-106倍梯度稀釋后感染細胞48 h，在400倍放大的熒光顯微鏡下觀察呈現綠色熒光的細胞個數，計算得三種抑制表達USE1的慢病毒質粒pLL3.7-shRNA1、pLL3.7-shRNA2、pLL3.7-shRNA3的病毒滴度分別為0.7×106TU/mL，1.0×106TU/mL 和 1.5×106TU/mL，符合滴度要求。同時發現，經10倍、100倍、1000倍稀釋的病毒感染細胞后，視野中呈現綠色熒光的細胞數逐漸減少，10倍稀釋的病毒感染細胞后仍有約70%的細胞呈現綠色熒光，圖2中A-I分別表示3種pLL3.7-shRNA1，2，3慢病毒包裝上清液在稀釋10倍、100倍、1 000倍后感染HEK-293細胞在熒光顯微鏡下的結果。由于濃縮后的病毒上清直接感染細胞48 h后會導致細胞死亡，故選擇10倍稀釋的病毒上清感染細胞進行后續實驗。

2.4 實時定量PCR檢測細胞中USE1基因的抑制表達效果

表2顯示了USE1基因的表達量，將表2中數據經Graph Pad Prism軟件處理后得到如圖3 所示的結果。從圖中可以看出，與未經病毒感染的空白對照CON組相比，包裝了pLL3.7-shRNA1質粒的慢病毒上清液感染HEK-293細胞后，USE1基因表達量沒有明顯減少，差異統計學意義不大（*P＞0.05），而包裝了pLL3.7-shRNA2和pLL3.7-shRNA3重組質粒的慢病毒上清感染HEK-293細胞后對USE1目的基因有50%的抑制作用（*P＜0.05），差異具有統計學意義，說明在設計的3條shRNA干擾序列中，shRNA2和shRNA3能夠有效抑制HEK-293細胞中USE1基因的表達。

圖2 三種梯度稀釋的慢病毒包裝液感染HEK-293細胞48 h后結果（400×）

表2 抑制USE1基因表達量RT-PCR檢測結果

2.5 Western Blot檢測細胞中USE1基因的抑制表達效果

圖3 RT-PCR檢測USE mRNA在HEK-293細胞中的表達（*P＜0.05）

從感染了10倍稀釋慢病毒上清液的HEK-293細胞中裂解蛋白，經Western Blot實驗從蛋白水平上檢測USE1基因的抑制表達效果，如圖4-A所示。其中1號孔為未經病毒感染的HEK-293細胞中USE1基因正常表達量，2號孔為陰性對照即轉染了pLL3.7-vector的HEK-293細胞中USE1基因的表達量，3-5 孔分別為感染了包裝pLL3.7-shRNA1、pLL3.7-shRNA2、pLL3.7-shRNA3質粒的慢病毒上清后細胞中USE1基因表達水平，從結果中可以看出與1號孔正常HEK-293細胞USE1基因的正常表達量和2號孔陰性對照組相比，3 號孔中USE1基因表達量沒有明顯減少，而4、5 號孔中USE1基因表達量明顯降低。經灰度量化分析后得到如圖4-B所示的結果，結果進一步表明，相對于空白對照組，包裝了pLL3.7-shRNA2和pLL3.7-shRNA3重組質粒的慢病毒上清感染細胞后具有約50%抑制USE1基因表達的效果（*P＜0.01）。

3 討論

泛素化作為普遍存在于真核生物體內的蛋白翻譯后修飾機制，在介導內源性蛋白降解、調控細胞周期與細胞凋亡、參與多種信號轉導、參與DNA損傷修復及轉錄調控、協同自噬作用等多個重要的胞內反應中發揮重要作用［12］。泛素化作用底物繁多且通路網絡復雜，當其機制出現異常，往往會導致胞內蛋白水平失衡，胞內多種生理活動不能正常進行，進而引發包括腫瘤、神經退行性疾病、炎癥及風濕性疾病等［13-15］，因此，維持泛素化正常進行對于更新胞內蛋白、清除衰老及錯誤折疊蛋白、維持機體內環境穩定具有重大意義［16］。由于泛素結合酶E2和泛素連接酶E3成員眾多，彼此間作用相互交錯導致目前對某條特異的泛素化通路中，E2-E3及E3-底物蛋白間的具體的相互作用仍然模糊。而第二個泛素活化酶Uba6自發現以來，對其功能的認識依然不足，而對其特異性泛素結合酶USE1的研究更少，對這條特異性泛素化通路的研究對發現泛素活化酶Uba6功能、發現潛在有價值的底物蛋白、豐富泛素化理論等方面具有重要意義。

圖4 Western Blot檢測USE1基因在HKE-293細胞中的表達（*P＜0.01）

慢病毒載體是以人類免疫缺陷I型病毒HIV-1為基礎建立的，對分裂細胞和非分裂細胞均有強感染力的一種載體，被廣泛應用于RNA干擾技術、基因治療等研究中［17-18］。當慢病毒進入細胞后，病毒RNA反轉錄進入細胞核中，可穩定整合至宿主基因組上，通過轉染至細胞中可產生表達shRNA的高滴度病毒，實現在多種細胞中特異、穩定的基因沉默效果［19-20］。根據靶標基因的序列設計的shRNA可通過克隆到慢病毒表達載體上，經轉錄后折疊形成發卡結構，在細胞內進一步加工成siRNA，誘導同源靶基因的mRNA降解，發揮RNA干擾作用，沉默靶標基因的表達［21］。

基于以上理論基礎，本實驗在前期探索泛素活化酶Uba1和Uba6分別對應的特異性泛素化通路研究的基礎上，加入了對Uba6的特異性泛素結合酶USE1研究，利用慢病毒載體干擾技術，設計3條靶向USE1基因的shRNA干擾序列，構建3種抑制USE1基因表達的慢病毒載體，經慢病毒包裝、感染細胞后檢測其抑制USE1基因表達情況，得到能夠有效抑制USE1基因表達的細胞株。本實驗成功構建了3種序列正確的USE1基因抑制表達慢病毒載體，經mRNA水平及蛋白水平檢測，其中2種慢病毒重組質粒經包裝轉染至HEK-293細胞后，可有效抑制USE1基因的表達，編號分別為shRNA-2、shRNA-3，病毒包裝液感染細胞后可得抑制USE1基因表達的細胞株，為后續實驗中對比、尋找過表達USE1基因和正常表達USE1基因細胞株中泛素化對應的下游底物奠定基礎，也為進一步研究Uba6-USE1這條特異性泛素化通路的功能提供依據。

4 結論

本研究基于泛素活化酶Uba6及其特異性泛素結合酶USE1的泛素化通路，為得到USE1基因的抑制表達細胞系，設計了3條靶向USE1基因的shRNA序列，成功構建了3種RNA干擾USE1基因表達的慢病毒重組質粒，經慢病毒包裝感染HEK 293細胞后檢測蛋白表達情況，最終確定并得到了其中2種抑制USE1基因表達率在50%左右的shRNA序列及其慢病毒包裝上清液，病毒上清感染細胞后即可得到抑制USE1基因表達的細胞株。