公共場(chǎng)所水環(huán)境中活嗜肺軍團(tuán)菌的快速檢測(cè)方法

郭沛 趙龍 胡翮

（湖南省湘潭市食品藥品檢驗(yàn)所，湘潭 411100）

軍團(tuán)菌病是一種細(xì)菌性疾病，主要表現(xiàn)為自限性非肺炎性龐蒂亞克熱（Pontiac fever）和軍團(tuán)菌病癥狀，其特征是嚴(yán)重的呼吸道癥狀，包括具有高度致命性的肺炎。感染的病原菌為軍團(tuán)菌，主要是嗜肺軍團(tuán)菌，約占90%以上［1-2］。軍團(tuán)菌可在25-45℃的溫水中生長(zhǎng)，廣泛存在于人工、自然水環(huán)境以及各種人工供水設(shè)施中，在具有復(fù)雜水管系統(tǒng)的建筑物中較為常見(jiàn)，如淋浴頭、供水管道、水龍頭、浴缸和空調(diào)裝置等，其主要原因在于這些管道的供水水流緩慢，甚至停滯［3］。

人們常在吸入經(jīng)軍團(tuán)菌污染的水霧后感染，尤其是老年人、免疫功能缺陷或低下的患者、吸煙者和慢性呼吸道疾病患者［4］。最好的預(yù)防方法是將水溫調(diào)節(jié)至20℃以下或者60℃以上，輸水管道中的水溫保持在55℃以上［3，5］。為了防止?fàn)C傷，可在水源使用點(diǎn)應(yīng)安裝溫度調(diào)節(jié)裝置。其他的預(yù)防措施還包括合理建設(shè)供水系統(tǒng)以盡可能地減少水流停滯、使用特殊材料防止微生物生長(zhǎng)等［5］。

軍團(tuán)菌病在全球范圍均有發(fā)生，尚有大量未報(bào)到的病例［2］。最近，瑞士制定了軍團(tuán)菌在公共浴室和淋浴水中的微生物標(biāo)準(zhǔn)（FSVO 2017）來(lái)預(yù)防軍團(tuán)菌病。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織也制定了相關(guān)的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)方法（ISO 11731），以檢測(cè)水樣是否符合微生物標(biāo)準(zhǔn)，該方法采用選擇性瓊脂平板培養(yǎng)后檢測(cè)病原體并計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)（ISO 2008）。Kirschner等［6］的研究表明這種方法耗時(shí)，檢測(cè)時(shí)間常大于10 d，同時(shí)由于技術(shù)限制或其他原因，部分軍團(tuán)菌可能具有活性但無(wú)法通過(guò)培養(yǎng)證實(shí)，即“活的非可培養(yǎng)狀態(tài)”（Viable but not culturable status，VBNC），而容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果［6-8］。在一定條件下，這部分軍團(tuán)菌能夠恢復(fù)毒力和感染宿主的能力［9］。目前，以分子為基礎(chǔ)的快速檢測(cè)方法得到迅速發(fā)展，但應(yīng)用該方法檢測(cè)微生物時(shí)，不論是否具有活性的微生物均能被檢測(cè)出來(lái)，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果的產(chǎn)生。采用DNA插層劑的方法可以區(qū)分病原微生物是否具有活性，但是同樣存在缺點(diǎn)，如生物膜的存在會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果［9］、試劑對(duì)檢測(cè)物的濃度依賴(lài)性細(xì)胞毒性作用［10］。

一種檢測(cè)活嗜肺軍團(tuán)菌的分子檢測(cè)方法能夠有效地解決這一問(wèn)題，該方法基于PCR檢測(cè)16S rRNA前體中特異性的靶點(diǎn)，這種靶點(diǎn)僅存在于活的嗜肺軍團(tuán)菌中，有望成為ISO方法的另一可選方案。前體rRNA在微生物rRNA總量中占據(jù)了很大的一部分，由于其具有較高的穩(wěn)定性，比mRNA更容易檢測(cè)和處理［11］。前體rRNA是由生長(zhǎng)中的細(xì)菌合成的，在rRNA成熟過(guò)程中其頭端和尾端的序列將隨后被刪除［11-12］。當(dāng)微生物生長(zhǎng)停滯時(shí)，其前體rRNA的合成停止，但繼續(xù)成熟，從而導(dǎo)致前體rRNA大量流失，因此，前體rRNA的存在可作為判斷微生物細(xì)胞活性的分子指標(biāo)［11，13-14］。

由于水為軍團(tuán)菌提供的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有限，細(xì)胞群很少處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，水中前體rRNA含量處于低水平［7］。將饑餓的軍團(tuán)菌轉(zhuǎn)移至新鮮的培養(yǎng)基中可刺激其生長(zhǎng)，導(dǎo)致rRNA的合成大量增加，隨后再用核酸提取和逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR方法（Quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR）檢測(cè)16S rRNA前體，可以極大地提高檢測(cè)效能。本研究分別應(yīng)用預(yù)刺激RT-qPCR法和ISO法對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌、非嗜肺軍團(tuán)菌以及非軍團(tuán)菌進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證兩種方法的特異性和靈敏度。隨后分別應(yīng)用這兩種方法檢測(cè)公共場(chǎng)所水環(huán)境中嗜肺軍團(tuán)菌水平及污染情況，比較兩者結(jié)果的一致性，從而探究該預(yù)刺激方法在公共場(chǎng)所水環(huán)境中快速檢測(cè)中的應(yīng)用效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病原菌株 嗜肺軍團(tuán)菌（ATCC 33152、ATCC 33153）、約旦軍團(tuán)菌（ATCC 33623）、長(zhǎng)灘軍團(tuán)菌（ATCC 33462）、普通大腸桿菌（ATCC 25922）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、腸炎沙門(mén)氏菌（ATCC 13076）、金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）均由美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American type culture collection，ATCC）提供。

1.1.2 儀器與試劑 E.Z.N.A. Total RNA Kit試劑盒（美國(guó)Omega公司）；One Step PrimeScript RT-PCR Kit試劑盒（日本TaKaRa公司）；熒光定量PCR儀（美國(guó)Roche公司）；5720R臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀TC10（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物及探針的設(shè)計(jì)與合成 嗜肺軍團(tuán)菌16S rRNA的上、下游引物序列分別為：5'-CGAGAGCTAGTGCCGGAAT-3'，5'-CCAAGTTGTCCCCCTCTTC-3'；嗜肺軍團(tuán)菌16S rRNA的探針序列為：5'-FAMTAGACAGATGGCGAGTGGCGAACG-BHQ1-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度177 bp。上述引物及探針均由上海閃晶分子生物科技有限公司合成。采用核苷酸BLAST工具（https：/blst.ncbi.nlm.nih.gov）進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬分析序列同源性檢索，結(jié)果表明引物和探針對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌具有高度特異性。

1.2.2 菌株的培養(yǎng) 軍團(tuán)菌菌株在含L-半胱氨酸的BCYE瓊脂平板上培養(yǎng)，非軍團(tuán)菌在5%羊血瓊脂平板上培養(yǎng)，挑選單個(gè)的菌落制備成含菌量為105CFU/μL的細(xì)菌混懸液供實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)菌株的預(yù)處理與模板制備 將實(shí)驗(yàn)菌株分為預(yù)刺激組（Pre-stimulated Group，PSG）和普通組（Ordinary group，OG）兩組，分別進(jìn)行預(yù)刺激處理和普通處理。取普通組細(xì)胞混懸液1-1.5 mL EP管中離心，16 000 r/min，4℃，5 min，棄上清液留沉淀。預(yù)刺激組細(xì)胞混懸液取1 mL置于50 mL離心管內(nèi)，加入9 mL已預(yù)熱的含L-半胱氨酸的BCYE培養(yǎng)基，37℃孵育一段時(shí)間后離心，丟棄9 mL上清液。剩余物轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中再離心16 000 r/min，4℃，5 min，棄上清液留沉淀。采用E.Z.N.A. Total RNA Kit試劑盒制備RNA模板，待測(cè)的RNA樣品提取后立即進(jìn)行分析，隨后置于-70℃冰箱中。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 反應(yīng)體系（25 μL）為 2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 10 μL、TaKaRa Ex Taq HS（5 U/μL）0.4 μL、PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.4 μL、PCR Forward Primer（10 μmol/L）1 μL、PCR Reverse Primer（10 μmol/L）1 μL、Probe 0.5 μL、待測(cè)樣品 5 μL、DEPC 水補(bǔ)足至 25 μL。PCR擴(kuò)增條件為：50℃逆轉(zhuǎn)錄30 min；95℃預(yù)變性15 min；95℃變性15 s，60℃退火延伸60 s，40個(gè)循環(huán)。RT-qPCR檢測(cè)的結(jié)果判定以Ct值≤35且擴(kuò)增曲線(xiàn)呈S型為陽(yáng)性。

1.2.5 預(yù)刺激時(shí)間的選擇 嗜肺軍團(tuán)菌先進(jìn)行饑餓預(yù)處理：取標(biāo)準(zhǔn)嗜肺軍團(tuán)菌1 mL置于50 mL離心管內(nèi)，加入9 mL已預(yù)熱的DEPC水，恒溫37℃孵育24 h，從而抑制16S rRNA前體的合成及分泌。將人工饑餓處理后的嗜肺軍團(tuán)菌分為9組，分別進(jìn)行普通處理（1組）及預(yù)刺激處理（8組），預(yù)刺激組分別于刺激后20、40、60、80、100、120、180 及 250 min 進(jìn)行收集實(shí)驗(yàn)樣品，普通組即為預(yù)刺激后0 min。提取實(shí)驗(yàn)樣本RNA，進(jìn)行RT-qPCR。CT轉(zhuǎn)化值是指預(yù)刺激組與普通組的CT值（CT Value）的差值。

1.2.6 特異性分析 提取包括嗜肺軍團(tuán)菌（ATCC 33152、ATCC 33153）、約旦軍團(tuán)菌（ATCC 33623）、長(zhǎng)灘軍團(tuán)菌（ATCC 33462）、普通大腸桿菌（ATCC 25922）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、腸炎沙門(mén)氏菌（ATCC 13076）、金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）在內(nèi)8株實(shí)驗(yàn)菌株的RNA，采用預(yù)刺激RT-qPCR法檢測(cè)的16S rRNA前體的表達(dá)，對(duì)比ISO法檢測(cè)的結(jié)果，分析兩種方法檢測(cè)水樣中嗜肺軍團(tuán)菌的特異性。

1.2.7 靈敏度分析 將饑餓處理后的標(biāo)準(zhǔn)軍團(tuán)菌株混 懸液按照 106、105、104、103、102、101Cell/L 的濃度進(jìn)行稀釋?zhuān)謩e采用預(yù)刺激法RT-qPCR方法和ISO法檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌的表達(dá)，分析兩種方法檢測(cè)水樣中嗜肺軍團(tuán)菌的靈敏度，結(jié)果用最低檢測(cè)濃度（Limit of detection，LOD）表示。

1.2.8 外環(huán)境水樣檢測(cè) 自2017年6月-2017年8月于湖南省湘潭市選擇賓館、飯館、超市、醫(yī)院等公共場(chǎng)所，采集場(chǎng)所自來(lái)水、淋浴水、空調(diào)冷卻水等水樣本。采集自來(lái)水和淋浴水前應(yīng)先用酒精棉球擦拭出水口，并放水1-2 min后采樣。冷卻水取自集水池液面下20 cm處。公共水環(huán)境的水樣分別進(jìn)行預(yù)刺激RT-qPCR法及ISO標(biāo)準(zhǔn)法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入及分析，計(jì)數(shù)資料組間比較采用卡方檢驗(yàn)分析，P＜0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 預(yù)刺激時(shí)間的選擇

不同預(yù)刺激時(shí)間（0、20、40、60、80、100、120、180和240 min）處理嗜肺軍團(tuán)菌后，RT-qPCR結(jié)果顯示隨著預(yù)刺激時(shí)間延長(zhǎng)，CT值逐漸減少，而相對(duì)應(yīng)的CT轉(zhuǎn)換值逐漸增加，分別為9.2、10.9、12.6、13.1、13.8、14.4、14.8、15.0 個(gè)循環(huán)（表 1）。當(dāng)預(yù)刺激時(shí)間＞3 h時(shí)，CT轉(zhuǎn)換值的增加明顯變緩（圖 1）。

圖1 不同預(yù)刺激時(shí)間處理嗜肺軍團(tuán)菌CT值變化

2.2 特異性檢測(cè)

采用熒光定量PCR檢測(cè)2株嗜肺軍團(tuán)菌、2株非嗜肺軍團(tuán)菌、4株非軍團(tuán)菌株的16S rRNA前體的表達(dá)，結(jié)果（表1）表明預(yù)刺激RT-qPCR法和ISO法檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌的特異性均為100%。2株嗜肺軍團(tuán)菌的16S rRNA前體的編碼序列檢測(cè)為陽(yáng)性，而2株非嗜肺軍團(tuán)菌、4株非軍團(tuán)菌的16S rRNA前體的編碼序列檢測(cè)為陰性，結(jié)果與ISO標(biāo)準(zhǔn)法完全一致。

表1 不同預(yù)刺激時(shí)間處理嗜肺軍團(tuán)菌CT值變化

2.3 靈敏度檢測(cè)

將饑餓處理后的標(biāo)準(zhǔn)嗜肺軍團(tuán)菌株混懸液按照106、105、104、103、102、101Cell/L的濃度進(jìn)行稀釋?zhuān)捎妙A(yù)刺激RT-qPCR法、ISO標(biāo)準(zhǔn)法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，預(yù)刺激法在濃度為106、105、104、103、102Cell/L的嗜肺軍團(tuán)菌混懸液檢測(cè)呈陽(yáng)性，而在101Cell/L的嗜肺軍團(tuán)菌混懸液檢測(cè)呈陰性，因此預(yù)刺激RT-qPCR法的LOD為102Cell/L；ISO標(biāo)準(zhǔn)法在濃度為106、105、104Cell/L的嗜肺軍團(tuán)菌混懸液檢測(cè)呈陽(yáng)性，而在103、102、101Cell/L的嗜肺軍團(tuán)菌混懸液檢測(cè)呈陰性，因此ISO標(biāo)準(zhǔn)法的LOD為104Cell/L（表 3）。

表2 嗜肺軍團(tuán)菌經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)法與預(yù)刺激法處理后的特異性差異

表3 嗜肺軍團(tuán)菌經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)法與預(yù)刺激法處理后的靈敏度比較

2.4 外環(huán)境水樣檢測(cè)

2.4.1 一般情況 調(diào)查湖南省湘潭市地區(qū)的賓館12家、飯館10家、超市3家、醫(yī)院2家等公共場(chǎng)所的自來(lái)水、淋浴水以及空調(diào)冷卻水，共計(jì)69份水樣品。預(yù)刺激RT-qPCR法及ISO標(biāo)準(zhǔn)法的總陽(yáng)性率分別為43.5%（30/69）和40.6%（28/69）。

將預(yù)刺激RT-qPCR法與ISO標(biāo)準(zhǔn)法進(jìn)行對(duì)比，預(yù)刺激RT-qPCR法與ISO標(biāo)準(zhǔn)法的一致率為94%，其中27份水樣檢測(cè)呈陽(yáng)性，38份水樣呈陰性；兩種檢測(cè)方法中約有6%的水樣出現(xiàn)差異性表達(dá)，其中3份水樣檢測(cè)結(jié)果預(yù)刺激RT-qPCR法呈陽(yáng)性而ISO標(biāo)準(zhǔn)法檢測(cè)呈陰性，1份水樣檢測(cè)結(jié)果預(yù)刺激RT-qPCR法呈陰性而ISO標(biāo)準(zhǔn)法檢測(cè)呈陽(yáng)性（表 4）。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)法和預(yù)刺激法比較 每份水樣均進(jìn)行預(yù)刺激RT-qPCR法及ISO標(biāo)準(zhǔn)法檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果詳見(jiàn)表5。兩組數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，預(yù)刺激RT-qPCR法及ISO標(biāo)準(zhǔn)法分別檢測(cè)水環(huán)境中嗜肺軍團(tuán)菌的表達(dá)，差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（C2=0.119，P=0.730）。

表4 外環(huán)境中嗜肺軍團(tuán)菌ISO標(biāo)準(zhǔn)法與預(yù)刺激法檢測(cè)結(jié)果

表5 外環(huán)境中嗜肺軍團(tuán)菌兩種檢測(cè)方法的比較

3 討論

嗜肺軍團(tuán)菌是一種革蘭染色陰性的機(jī)會(huì)致病菌，廣泛存在于公共場(chǎng)所水環(huán)境中，如空調(diào)冷卻水、供水系統(tǒng)、淋浴水、噴泉水。嗜肺軍團(tuán)菌可經(jīng)氣溶膠吸入引起以發(fā)熱及肺部感染為主要癥狀的軍團(tuán)菌病。因此，水環(huán)境中嗜肺軍團(tuán)菌的快速檢測(cè)及預(yù)警對(duì)控制人群中軍團(tuán)菌病的發(fā)生具有重要意義［15］。目前常用的嗜肺軍團(tuán)菌的檢測(cè)方法包括分離培養(yǎng)法、酶聯(lián)免疫吸附法、免疫熒光法和熒光定量PCR法等［16］。其中PCR技術(shù)具有快速定量檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，因而得到了迅速發(fā)展，但是其缺陷在于無(wú)法區(qū)分活菌及死菌，限制了其實(shí)際應(yīng)用。本研究首次提出預(yù)刺激RT-qPCR法檢測(cè)水樣中的活嗜肺軍團(tuán)菌，與金標(biāo)準(zhǔn)ISO法進(jìn)行對(duì)比，探究新檢測(cè)方法在實(shí)際應(yīng)用中的可行性。

預(yù)刺激RT-qPCR法通過(guò)誘導(dǎo)16S rRNA的合成增加，并采用RT-qPCR技術(shù)定量分析嗜肺軍團(tuán)菌的16S rRNA的表達(dá)水平，從而可定量檢測(cè)出活嗜肺軍團(tuán)菌。最佳預(yù)刺激時(shí)間的選擇是該方法應(yīng)首要解決的問(wèn)題，本研究通過(guò)分析不同預(yù)刺激時(shí)間處理嗜肺軍團(tuán)菌后的CT值變化來(lái)確定最佳預(yù)刺激時(shí)間。最佳預(yù)刺激時(shí)間的選擇應(yīng)盡可能的接近最大效應(yīng)時(shí)間，而小于軍團(tuán)菌的倍增時(shí)間。結(jié)果表明，預(yù)刺激時(shí)間設(shè)置為3 h是很合理的。饑餓處理后的嗜肺軍團(tuán)菌在預(yù)刺激1 h后即出現(xiàn)了明顯的CT值改變。Warren等［17］的研究表明嗜肺軍團(tuán)菌的倍增時(shí)間約為6 h甚至更多。當(dāng)預(yù)刺激時(shí)間超過(guò)3 h時(shí)，CT值增長(zhǎng)明顯緩慢［18-19］。因此，最佳預(yù)刺激時(shí)間設(shè)置為3 h，此時(shí)嗜肺軍團(tuán)菌16S rRNA的合成既接近于最大效應(yīng)值，又遠(yuǎn)小于軍團(tuán)菌的倍增時(shí)間6 h。

預(yù)刺激RT-qPCR法和ISO標(biāo)準(zhǔn)法的特異性分析表明，兩種方法特異性完全一致，均為100%；而在靈敏度檢測(cè)中，預(yù)刺激法的LOD為102Cell/L，ISO標(biāo)準(zhǔn)法的LOD為104Cell/L。因此，預(yù)刺激RT-qPCR法檢測(cè)具有高特異性和高靈敏度的特點(diǎn)。傳統(tǒng)經(jīng)典的軍團(tuán)菌檢測(cè)方法，即ISO標(biāo)準(zhǔn)法，是軍團(tuán)菌檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，據(jù)部分學(xué)者報(bào)道［20］其特異性高達(dá)100%，但Boss等［21］研究表明部分細(xì)菌經(jīng)ISO法檢測(cè)為假定的嗜肺軍團(tuán)菌，而通過(guò)基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析（MALDI-TOF MS）證實(shí)為不動(dòng)桿菌。需要指出的是，雖然本研究的特異性也為100%，但是僅進(jìn)行了2株嗜肺軍團(tuán)菌、2株非嗜肺軍團(tuán)菌、4株非軍團(tuán)菌株的檢測(cè)，受檢菌株少可能是的兩種方法特異性如此之高的部分原因。但是，部分歐洲的研究表明被報(bào)道的病例中絕大多數(shù)（約70%）的感染是由SG1型嗜肺軍團(tuán)菌引起，約有20%-30%是由SGs2-15型嗜肺軍團(tuán)菌引起［22］。本研究選用的2株嗜肺軍團(tuán)菌均為屬于SG1型嗜肺軍團(tuán)菌，具有普適性，因此對(duì)實(shí)際檢測(cè)中仍具有一定的指導(dǎo)意義。

公共場(chǎng)所水環(huán)境的檢測(cè)結(jié)果表明，預(yù)刺激RT-qPCR法與ISO標(biāo)準(zhǔn)法的結(jié)果基本一致，一致率為94%，兩者差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。預(yù)刺激RT-qPCR法是在熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qPCR）的基礎(chǔ)上改進(jìn)而來(lái)的，而qPCR是除了細(xì)菌培養(yǎng)外唯一一種編入ISO技術(shù)規(guī)范的嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，Omiccio Li等［23］對(duì)34株軍團(tuán)菌、16株非軍團(tuán)菌進(jìn)行檢測(cè)，認(rèn)為在軍團(tuán)菌檢測(cè)中，qPCR完全能夠取代分離培養(yǎng)法，而不僅僅只是其替代選項(xiàng)。Bonetta等［24］的研究也表明qPCR對(duì)外環(huán)境水樣中的軍團(tuán)菌檢測(cè)，其陽(yáng)性率遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法，能夠更加真實(shí)地反映出外環(huán)境中軍團(tuán)菌的污染情況。近年來(lái)，隨著衛(wèi)生行政部門(mén)對(duì)軍團(tuán)菌越來(lái)越重視，醫(yī)院、賓館等公共場(chǎng)所的空調(diào)水系統(tǒng)等被大量使用消毒劑用于消滅和去除軍團(tuán)菌。環(huán)境中的壓力和氧化還原條件等變化導(dǎo)致水樣中軍團(tuán)菌向生物膜及原蟲(chóng)體內(nèi)遷移，亦或者成為“活的非可培養(yǎng)狀態(tài)”，這種狀態(tài)下的軍團(tuán)菌無(wú)法被傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)法檢測(cè)出來(lái)。Greenhalgh等［25］的研究也證實(shí)了VBNC軍團(tuán)菌的存在可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。

此外，預(yù)刺激RT-qPCR法還具有快速檢測(cè)的特點(diǎn)。在收集水樣后的8 h即可獲得檢測(cè)結(jié)果，而ISO法至少需要花費(fèi)1周的時(shí)間。當(dāng)疾病疫情爆發(fā)流行時(shí)，快速檢測(cè)出水樣中的潛在感染源就顯得尤為重要。相較于傳統(tǒng)的核酸技術(shù)而言，預(yù)刺激RT-qPCR法還可區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞，該方法的理論基礎(chǔ)在于Cangelosi等［12］的研究發(fā)現(xiàn)16S rRNA前體在合成后其頭部及尾部的序列立即被刪除，因此利用16S rRNA可檢測(cè)出細(xì)胞是否具有活性。本研究探究了預(yù)刺激RT-qPCR法與ISO的在實(shí)驗(yàn)室條件下及實(shí)際應(yīng)用的差異，對(duì)該方法實(shí)際推廣有一定指導(dǎo)意義，同時(shí)也存在一定的局限，如本研究中實(shí)驗(yàn)菌株較少可能影響到兩種方法的評(píng)估，實(shí)驗(yàn)設(shè)備及技術(shù)要求較高導(dǎo)致難以在基層推廣。

4 結(jié)論

預(yù)刺激RT-qPCR法是一種快速有效的檢測(cè)活嗜肺軍團(tuán)菌的方法，診斷靈敏度及特異性高，是ISO標(biāo)準(zhǔn)法潛在的替代方案。特別是在需要快速取得檢測(cè)結(jié)果時(shí)，該方法可作為首選方案。