單增李斯特菌核糖核酸酶Rnase III RncS氨基酸突變對其降解RNA活性的影響

王立霞 孟慶玲 喬軍 蔡擴軍 王登峰 伍曄暉 郭晶 才學(xué)鵬

（1. 石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，石河子 832003；2. 烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心，烏魯木齊 830063；3. 新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，烏魯木齊 830000；4. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，蘭州 730046）

單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是一種革蘭氏陽性人獸共患胞內(nèi)寄生菌［1］，能引起人和動物的李斯特菌病。作為重要的食源性致病菌之一［2］，LM廣泛存在于自然環(huán)境中，可在高鹽、低溫和低pH 值條件下生存，嚴(yán)重威脅食品安全和公共衛(wèi)生［3-5］。同時，LM也是一種最常見的腐生菌，易污染動物飼草料，給畜牧業(yè)的發(fā)展造成嚴(yán)重的損失［6］。研究發(fā)現(xiàn)，LM的環(huán)境耐受能力和致病性與其基因組上編碼的多種應(yīng)激因子（VirR、Sigma B）和調(diào)控因子（PrfA、CodY）有著密切的關(guān)系［7］，而非編碼 RNAs（non-coding RNAs，ncRNAs）與這些蛋白分子組成了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對LM毒力和環(huán)境應(yīng)激相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和翻譯水平進行精細調(diào)控［8］。

RibonucleaseⅢ（RnaseⅢ）是一種保守性較高的雙鏈RNA特異性核酸內(nèi)切酶，其中細菌RNase III主要在rRNA成熟，mRNA降解和sRNA加工、轉(zhuǎn)換和sRNA依賴性mRNA降解中起作用［9-10］。前期研究證實［11］，LM RnaseⅢ是一種依賴于二價金屬陽離子的磷酸二酯酶，當(dāng)鎂離子存在時，該酶可發(fā)揮降解雙鏈結(jié)構(gòu)的RNA的活性，且隨鎂離子濃度不同其降解活性不同。然而，LM RnaseⅢ發(fā)揮酶活中的關(guān)鍵氨基酸位點至今尚未報道。鑒于此，本研究利用SOE-PCR技術(shù)構(gòu)建LM- RnaseⅢ-D50A、LMRnaseⅢ-E122A突變體，通過體外酶活試驗檢測其對RNA降解活性的變化，為深入揭示LM RnaseⅢ的作用特點和調(diào)控ncRNAs的分子機制奠定前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

LM-SB5野毒株由石河子大學(xué)動物疾病防控兵團重點實驗室保存；大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）和pET-32a（+）原核表達載體由本實驗室保存；重組RnaseⅢ RncS由本實驗室前期構(gòu)建保存；Taq DNA聚合酶、dNTPs、pMD19-T載體、限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、T4 DNA Ligase、DL-2 000 DNA Marker、DL-5 000 DNA Marker、蛋白 Marker、Trizol購自TaKaRa公司；MgCl2和MnCl2均購自北京北化精細化學(xué)品有限責(zé)任公司；兔抗LM陽性血清由本室制備；細菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG、低背景化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自TIANGEN公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)前期擴增的rncS基因序列及生物信息學(xué)分析結(jié)果，通過Primer 5.0軟件設(shè)計擴增rncS基因突變型D50A、E122A的特異性引物：D50A、E122A fragment1的擴增引物分別為H1、H2和R1、R2；D50A、E122A fragment1的擴增引物分別為H3、H4和R3、R4；重疊延伸PCR的引物分別為H1、H4和R1、R4；分析表達載體pET-32a（+）多克隆位點的情況，在H1、H4和R1、R4引物的5’端分別加酶切位點EcoRⅠ和XhoⅠ（下劃線）及保護性堿基（斜體）（表1）。引物由北京六合華大基因生物公司合成。

1.2.2 LMrncS基因結(jié)構(gòu)域分析及突變位點的選擇 應(yīng)用在線生物信息學(xué)分析軟件SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/smart/）預(yù)測 RnaseⅢ RncS蛋白結(jié)構(gòu)域；在NCBI中檢索大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、嗜熱桿菌、布魯氏菌等的RnaseⅢ氨基酸序列，利用DNAMAN 5.2.2軟件進行多序列比對，選擇高度保守的關(guān)鍵氨基酸進行突變。

1.2.3 LMrncS突變基因D50A、E122A的構(gòu)建與測序鑒定 提取LM-SB5菌株基因組DNA，以基因組DNA為模板，用H1/H2 和H3/H4兩對引物分別擴增D50A fragment1和fragment2，用R1/R2 和R3/R4兩對引物分別擴增E122A fragment1和fragment2。SOEPCR 采用 25 μL反應(yīng)體系：水 14.8 μL，fragment1和 fragment2 各 3 μL，10 × PCR buffer 2.5 μL，2.5 mmol/Lol/L dNTPs 1.5 μL，TaqDNA 聚 合 酶 0.2 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，55℃退火40 s，72℃延伸45 s，13個循環(huán)；再加入H1/H4和R1/R4引物各0.5 μL擴增片段的全長，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4min；95℃變性50 s，65℃退火40 s，72℃延伸1 min 40 s，30個循環(huán)；72℃延伸l0 min。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后回收目的片段，并將目的片段克隆至pMD19-T Simple載體中，挑取陽性單克隆進行測序，構(gòu)建突變質(zhì)粒pMD19-TD50A和pMD19-T-E122A。

表1 構(gòu)建突變型D50A、E122A的特異性引物

1.2.4 突變型重組表達載體的構(gòu)建與鑒定 將pET-32a（+）原核表達載體與測序正確的pMD19-TD50A和pMD19-T-E122A質(zhì)粒用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ同時進行雙酶切。回收目的片段和載體片段后用T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建突變型重組表達載體。經(jīng)菌液PCR和雙酶切鑒定，將鑒定正確的突變型重組表達質(zhì)粒命名為pET32a（+）-D50A和 pET32a（+）-E122A。

1.2.5 突變型重組蛋白的誘導(dǎo)表達、純化及Western blot鑒定 將鑒定正確的突變型重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）中，在Amp抗性的液體LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)至OD600nm為0.6-0.7，用IPTG進行誘導(dǎo)8 h，同時設(shè)置空載體對照，然后進行SDS-PAGE分析，利用鎳離子親和層析法純化突變型重組蛋白，同時，以兔抗LM陽性血清為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG為二抗，進行Western blot分析。

1.2.6 突變型重組RnaseⅢ D50A和RnaseⅢ E122A對RNA降解活性研究 提取LM 總RNA，分析LM重組 RnaseⅢ RncS突變對RNA降解活性的影響。設(shè)立RNA的空白對照和未突變的重組RnaseⅢRncS對照，同時，設(shè)立不同濃度的MgCl2和MnCl2，采用 20 μL 反應(yīng)體系：RNA 7 μL、RnaseⅢ RncS、RnaseⅢ D50A 和 RnaseⅢ E122A 均 3 μL、MgCl2（MnCl2）X，加Urtrapure water 10-X μL。將純化好的重組RnaseⅢ RncS及突變型重組LM RnaseⅢ D50A和LM RnaseⅢ E122A適當(dāng)稀釋，在不同濃度MgCl2（MnCl2），37℃條件下水浴15 min，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像系統(tǒng)觀察，定性地分析LM重組RnaseⅢ RncS突變對RNA降解活性的變化。同時，選取最佳濃度的MgCl2和MnCl2，按上述操作步驟，37℃條件下水浴15 min后分別測定各組的RNA濃度，并利用統(tǒng)計學(xué)方法定量分析LM重組RnaseⅢ RncS突變對RNA降解活性的變化。

2 結(jié)果

2.1 LM rncS結(jié)構(gòu)域分析及突變位點的選擇

SMART 軟件分析結(jié)果顯示，LM-RnaseⅢ蛋白氨基酸序列含有1個核酸酶結(jié)構(gòu)域（RIBOc，19-154）和1個雙鏈RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DSRM，160-227），其中核酸酶結(jié)構(gòu)域RIBOc中有含有5個活性位點（active，43、46、50、119、122）（圖 1）。通過DNAMAN多序列比對發(fā)現(xiàn)，這5個活性位點高度保守。

圖1 LM-RnaseⅢ RncS蛋白結(jié)構(gòu)域模式圖

2.2 LM rncS基因突變型D50A、E122A fragment1、

fragment2的擴增及重疊延伸PCR擴增結(jié)果

以LM 基因組DNA為模板，用H1/H2、H3/H4及R1/R2、R3/R4特異性引物分別擴增突變型D50A、E122A的fragment1和fragment2，分別擴增得到161 bp、529 bp、374 bp、316 bp的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。采用重疊延伸 PCR技術(shù)融合fragment1和fragment2，得到與預(yù)期值690 bp 相符的目的條帶（圖2）；陽性克隆pMD19-T-D50A和pMD19-T-E122A測序后的對比分析表明D50A、E122A已成功突變。

圖2 rncS基因突變株的克隆結(jié)果

2.3 突變基因重組表達載體的構(gòu)建與鑒定

突變型重組質(zhì)粒pET-32a（+）-D50A和pET-32a（+）-E122A用EcoRI/XhoI雙酶切得到均為690 bp的目的條帶和5 900 bp的pET-32a（+）片段（圖3），表明成功構(gòu)建了pET-32a（+）-D50A和pET-32a（+）-E122A突變型重組原核表達載體。

2.4 重組突變體D50A和E122A的誘導(dǎo)表達、純化與Western blot分析鑒定

圖3 rncS基因突變型重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

將構(gòu)建好的突變型重組表達載體pET-32a（+）-D50A和pET-32a（+）-E122A轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，篩選陽性菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達8 h后，通過SDS-PAGE分析，突變型重組菌pET-32a（+）-D50A和pET-32a（+）-E122A均出現(xiàn)了分子質(zhì)量為42.5 kD的特異性蛋白條帶。純化蛋白經(jīng) SDS-PAGE分析顯示，在相對分子質(zhì)量約42.5 kD處可見單一條帶，大小與預(yù)期值一致，結(jié)果表明純化的蛋白效果較好。經(jīng)Western blot分析鑒定，該突變型重組蛋白能與兔抗LM陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，表明克隆的LMrncS基因突變型D50A、E122A在大腸桿菌中獲得表達（圖4）。

圖4 突變型重組蛋白SDS-PAGE和Western blot分析

2.5 重組突變體RnaseⅢ D50A和RnaseⅢ E122A降解RNA活性分析

結(jié)果（圖5、圖6）顯示，當(dāng)缺乏Mn2+時，RnaseⅢ不能降解RNA，在低濃度的Mn2+和Mg2+條件下，RnaseⅢ的降解活性都較低，隨著離子濃度的增大，其降解活性也升高，其中Mn2+濃度為50 mmol/L，Mg2+濃度為10 mmol/L時，RnaseⅢ具有較強的降解活性，但當(dāng)Mn2+濃度大于100 mmol/L時，其降解活性減弱；在Mn2+濃度為50 mmol/L，Mg2+濃度為10 mmol/L的條件下，與對照組相比，將RnaseⅢ RncS第50位的天冬氨酸突變后，其降解活性減弱（P＜0.001），第122位的谷氨酸突變后降解活性顯著下降（P＜0.000 1）（圖7），表明RnaseⅢ發(fā)揮降解活性依賴于Mn2+或Mg2+，其中第122位的谷氨酸是維持RnaseⅢ RncS活性的關(guān)鍵位點。

圖5 Mn2+對RnaseⅢ及其突變型降解活性的檢測

圖6 Mg2+對RnaseⅢ及其突變型降解活性的檢測

圖7 RnaseⅢ及其突變型降解活性的檢測

3 討論

RnaseⅢ是一種廣泛存在于細菌、真核生物及噬菌體中的能夠切割具有雙鏈結(jié)構(gòu)RNA的核酸酶，Wanger［12］和 Darfeuille［13］等在大腸桿菌和沙門氏菌中研究證實，RnaseⅢ均參與了ncRNA的調(diào)控，影響基因的表達，從而調(diào)控細菌在宿主體內(nèi)的生存。研究發(fā)現(xiàn)，ncRNA在LM毒力和環(huán)境應(yīng)激適應(yīng)過程具有重要的作用［14］，然而，目前有關(guān)RnaseⅢ介導(dǎo)的ncRNA對其調(diào)控作用尚未研究。

序列比對發(fā)現(xiàn)，不同來源的細菌RNase III是一種保守性較高的酶家族，均含有9個保守氨基酸（ERLEFLGDA）組成的RNase III 識別基序，是維持其酶降解活性的重要位點。RNase III起同源二聚體的作用，通過核糖核酸酶結(jié)構(gòu)域發(fā)生二聚化，兩個核糖核酸酶結(jié)構(gòu)域組合形成單個加工中心，每個結(jié)構(gòu)域有助于雙鏈底物的一條RNA鏈的水解［15］。Blaszczyk等［16］在嗜熱桿菌（Aquifex aeolicus）Aa-RNase III與dsRNA復(fù)合體晶體結(jié)構(gòu)中研究發(fā)現(xiàn)，兩個RNase III單體通過NucD區(qū)的疏水作用和氫鍵結(jié)合形成二聚體結(jié)構(gòu)，在兩個單體作用界面形成一個催化谷（valley）結(jié)構(gòu)用于結(jié)合RNA。因為單體蛋白靠近，來自同一亞基的五個酸性殘基E38、E41、D45、D114和E117和一個來自伴侶亞基的E65簇位于催化谷的兩端組成一個活性中心。在大腸桿菌中研究發(fā)現(xiàn)，E38參與蛋白質(zhì)二聚化；E65參與底物識別和裂變鍵選擇［15］；D45、D114和D117螯合Mn2+離子［17］；E41、D45、D114和 E117進行易斷裂鍵的水解［18］。本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，LM-RNaseIII含有1個核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域（RIBOc）和1個dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DSRM），且核酸酶結(jié)構(gòu)域RIBOc中的5個活性位點在其它細菌RNaseIII中高度保守。

目前，細菌RNaseIII蛋白是研究最廣泛的一類磷酸二酯酶［19］。Sun等［17］研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌RNaseIII發(fā)揮降解活性依賴于Mn2+或Mg2+。另外，Blaszczyk等［20］在嗜熱桿菌中研究發(fā)現(xiàn)，Mn2+或Mg2+離子為RNase III發(fā)揮活性所必須；當(dāng)其第110位的E突變?yōu)镵后，Aa-RNase III-E110K能與dsRNA結(jié)合，但失去切割活性。Lioliou等［21］將金黃色葡萄球菌RNase III中的殘基E135和D63均突變成丙氨酸后，證實Sa-RNase III-D63A和Sa-RNase III-E135A降解活性顯著降低。許先進［22］將布魯氏菌 RNase III中的E54、D61、E81、E133均突變成丙氨酸后，證實這四種突變蛋白均能與布魯氏菌自身編碼的dsRNA BM-pre-0015結(jié)合，但RNaseIIIE133A的結(jié)合能力和切割活性顯著降低，表明E133是其發(fā)揮酶活所必須的。本研究通過體外酶活試驗檢測發(fā)現(xiàn)，不同濃度的Mn2+或Mg2+對LM-RNaseIII的降解活性不同，其中Mn2+為50 mmol/L、Mg2+為10 mmol/L時具體較好的降解活性。另外，構(gòu)建的LM-RNase III-E122A突變體降解活性顯著降低，提示LM-RNase III中的第122位谷氨酸是其維持酶活性的關(guān)鍵位點，為進一步揭示RnaseⅢ對LM ncRNA的作用方式和調(diào)控機制奠定前期基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究利用生物信息學(xué)軟件分析了LM-RNaseIII結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示，LM-RnaseⅢ氨基酸序列含有1個核酸酶結(jié)構(gòu)域（RIBOc）和1個雙鏈RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DSRM），其中結(jié)構(gòu)域RIBOc中有含有5個活性位點；應(yīng)用SOE-PCR技術(shù)構(gòu)建了突變型LM-RnaseⅢ-D50A和LM-RnaseⅢ-E122A，并通過體外酶活實驗檢測顯示，RnaseⅢ發(fā)揮降解活性依賴于Mn2+或Mg2+，將其第50位天冬氨酸突變后，RnaseⅢ RncS的降解活性有所降低；第122位谷氨酸突變后，RnaseⅢ RncS 降解活性顯著下降，提示第122位谷氨酸是維持LM RnaseⅢ RncS酶活性的關(guān)鍵位點。