氨濃度升高對CHO細胞維持期抗體融合蛋白的表達及N-糖基化的影響

陳欣寧 趙亮 范里 劉旭平 譚文松

（華東理工大學 生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237）

抗體類藥物是近年來研發數量最多、銷售增長速度最快的治療性重組蛋白藥物，它具有靶向明確、安全性高和循環半衰期長等優點，已被批準用于癌癥、免疫性疾病、病毒感染等多種疾病的治療［1］。抗體類藥物生產用最主要的宿主細胞是CHO細胞，這是因為由CHO細胞表達的重組蛋白具有與人體血清蛋白高度相似的糖鏈結構［2］。而抗體類藥物的糖鏈結構（如唾液酸化、半乳糖化、巖藻糖化和高甘露糖比例等）與蛋白分子的電荷分布、穩定性和溶解性等理化性質以及藥物的藥代動力學和生物學活性等體內藥效密切相關［3-4］，因此糖基化是抗體類藥物的關鍵質量屬性之一。隨著動物細胞大規模培養技術的不斷進步，細胞生長和產物表達水平明顯提高。目前在優化的CHO細胞流加培養過程中，最高活細胞密度和產物表達量分別能達到1-2×107cells/ml和g/L級［5］。然而在產物大量合成的高密度細胞培養過程中，培養環境更為復雜，較易發生過程參數滲透壓和二氧化碳分壓累積以及代謝副產物氨的濃度升高的情況，會對細胞生長與維持和產物表達與糖基化過程產生不利影響［6-8］。

氨是動物細胞培養過程中的主要代謝副產物之一，它主要是由細胞代謝谷氨酰胺和天冬酰胺生成，少部分是谷氨酰胺自發降解產生［9］。在高密度細胞流加培養過程中氨的濃度往往不斷升高，細胞維持期（產物表達期）的氨濃度通常達到6-10 mmol/L［5，10］， 有 些 培 養 過 程 中 甚 至 超 過10 mmol/L［11］。高濃度的氨通過擴散作用進入胞漿以及線粒體、高爾基體和內質網等細胞器，導致胞漿和這些細胞器內的pH升高，進而影響了正常的胞內生化反應，如物質和能量代謝、糖鏈加工、蛋白質翻譯等［9，12］。研究表明，在初始培養時提高氨的濃度會影響產物表達和糖基化過程［13-15］，由于在初始培養時提高氨的濃度會同時影響細胞生長和代謝水平，而產物表達和糖基化過程與培養前期的細胞生長和代謝水平密切相關［16-17］，導致在這些研究中氨本身對產物表達和糖基化過程的影響更為復雜。考慮到在細胞培養過程中，細胞生長期的氨濃度和產物表達量較低，而在產物大量合成的細胞維持期氨濃度較高。因此，細胞維持期氨對產物的表達和糖鏈結構的影響更應該被關注。

為此，本研究考察了在表達抗體融合蛋白的CHO細胞流加培養過程中，不同的氨濃度在細胞維持期對細胞維持與代謝、抗體融合蛋白表達以及N-糖基化的作用，認識氨濃度升高對抗體融合蛋白的表達和N-糖鏈結構的影響，從而對表達抗體類藥物以及其它治療性重組蛋白的細胞培養過程開發與控制奠定部分基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的細胞為表達抗體融合蛋白的重組CHO細胞株。種子細胞傳代培養基和基礎培養基相同，為本實驗室自主開發的無血清無蛋白培養基［18］。流加培養基為葡萄糖和氨基酸的濃縮液。用于配制培養基的所有試劑和原料均從Sigma-Aldrich公司購買。配制完的培養基經0.22 μm濾膜（Millipore）過濾除菌后使用。

1.2 方法

1.2.1 種子細胞培養 從液氮罐中取出凍存的CHO種子細胞，加入至含有10 mL種子傳代培養基的離心管中，經1 000 r/min離心5 min后棄去培養上清。用適量種子傳代培養基重懸細胞，控制活細胞密度為5.0-8.0×105cells/mL。將細胞懸液轉移至125 mL搖瓶中（美國Corning公司），置于培養箱中的搖床上（杭州奧盛儀器有限公司）進行培養，培養條件為37℃、5% CO2和120 r/min。每天對種子細胞進行傳代，控制傳代后種子細胞的活細胞密度為5.0-8.0×105cells/mL。

1.2.2 流加培養 取處于對數生長期的種子細胞，經1 000 r/min離心5 min后棄去培養上清，用基礎培養基重懸細胞，控制活細胞密度為1.0×106cells/mL，接種體積為80 mL。將細胞懸液轉移至250 mL搖瓶中（美國Corning公司），置于培養箱中的搖床上進行培養，培養條件為37℃、5% CO2和120 r/min。每天添加3%（V/V）的流加培養基。當細胞生長至最大活細胞密度時（培養第5天），一次性添加不同濃度的氯化銨濃縮液，分別使培養液中的氨濃度升高0（不添加）、2、4和6 mmol/L后繼續培養。每組實驗設置3個重復。每天取樣1 mL進行細胞密度和活率檢測，培養液經10 000 r/min離心5 min后取上清液于-80℃保存，用于主要代謝物和副產物濃度、抗體融合蛋白表達量和純化后的糖基化檢測。

1.2.3 細胞密度和活率檢測 細胞培養液用磷酸緩沖液和0.4%（W/V）臺盼藍染色液稀釋后，加到血球計數板中計錄活細胞數和死細胞數，活細胞數占總細胞數的百分比即為活率。同時采用Countstar細胞計數儀（上海睿鈺生物科技有限公司）記錄細胞形態。

1.2.4 細胞凋亡檢測 使用Dead Cell Apoptosis Kit（美國Thermo Fisher公司）對凋亡細胞比例進行檢測。首先取細胞1.0×106cells/mL，離心除去培養液并用PBS緩沖液清洗細胞兩次。將細胞沉淀重懸于100 μL 1×Annexin binding buffer中，檢測樣本添加1 μL PI溶液和 5 μl Annexin V-FITC 溶液，同時設置不添加PI和Annexin V-FITC溶液的檢測對照組，室溫避光放置15 min后加入400 μL 1×Annexin binding buffer并充分混勻。采用流式細胞儀（美國BD公司）檢測結果，用Flowjo軟件（美國BD公司）進行數據分析。

1.2.5 主要代謝物和副產物濃度檢測 培養上清中的主要代謝物葡萄糖和谷氨酰胺、代謝副產物乳酸和氨的濃度采用生化分析儀Nova BioProfile 400（Nova Biomedical）測定。

1.2.6 抗體融合蛋白表達量檢測 培養上清中抗體融合蛋白的表達量采用尺寸排阻色譜的方法進行檢測，色譜柱為G3000SWXL，7.8×300 mm（TOSOH）。具體步驟見參考文獻［19］。

1.2.7 抗體融合蛋白純化 抗體融合蛋白的純化采用Protein A親和層析的方法，純化柱為Mab Select SuRe（GE Healthcare）。具體步驟見參考文獻［19］。

1.2.8 抗體融合蛋白唾液酸含量檢測 按照2015年版《中國藥典》（三部）中間苯二酚顯色法檢測抗體融合蛋白的唾液酸含量。

1.2.9 抗體融合蛋白N-糖鏈結構檢測 抗體融合蛋白的N-糖鏈結構采用2-對氨基苯甲酰胺標記法進行檢測［20］。首先用糖苷酶PNGase F（New England BioLabs）將N端糖鏈從抗體融合蛋白上切除，隨后加入-20℃的乙醇，12 000 r/min離心10 min后吸取上清，置于真空離心濃縮儀（Thermo）中揮發溶液。然后使用2-對氨基苯甲酰胺熒光標記物（Prozyme）按照試劑盒說明書要求與糖鏈反應，最后通過TSKGEL Amide-80，4.6×250 mm（TOSOH）色譜柱檢測樣品的N-糖鏈結構，流動相A為50 mmol/L 甲酸銨（pH4.4），流動相B為乙腈，梯度條件為在140 min內由30%-55%流動相A 的線性梯度洗脫，流速為0.4 mL/min。檢測器為熒光檢測器（Waters），激發波長為330 nm，發射波長為420 nm。

圖1 抗體融合蛋白的N-糖鏈結構譜圖

1.2.10 數據分析 抗體融合蛋白的比生成速率qp（pg/cell/day）的計算公式如下：

其中Titer為抗體抗體融合蛋白的表達量（mg/L）；IVCC（Integrated viable cell concentraion）為活細胞密度對培養時間的積分（109cells·day/L）。

培養上清中主要代謝物和副產物的比生成/消耗速率qm（pmol/cell/day）的計算公式如下：

其中Concentration為代謝物或副產物的濃度（mmol/L）。

抗體融合蛋白的唾液酸化（Sialylation）、半乳糖化（Galactosylation）、巖藻糖化（Fuosylation）程度的計算公式如下：

Sialylation=［0.5×（A1+A1F）+A2+A2F］×100%

Galactosylation=［0.5×（G1+G1F）+G2+G2F+A1+A1F+A2+A2F］×100%

Fucosylation=（G0F+G1F+G2F+A1F+A2F）×100%

其中抗體融合蛋白的G0、G2、A2F等糖鏈的具體結構參考圖1。

2 結果

2.1 氨濃度升高對CHO細胞維持以及抗體融合蛋白表達的影響

為了排除維持期細胞密度對抗體融合蛋白的表達以及N-糖鏈結構的影響，在細胞生長至最高活細胞密度時（培養第5天），往培養液中一次性加入不同濃度的氯化銨濃縮液使氨濃度分別上升0（對照組）、2、4和6 mmol/L，以營造只有氨濃度不同的細胞維持期培養環境。同時，為了避免因細胞后期死亡而釋放至培養液的宿主蛋白酶和糖苷酶對抗體融合蛋白及其糖鏈的降解，在培養第11天時（細胞活率＞90%）結束培養。

圖2 不同氨濃度條件下的CHO細胞維持（A）、細胞活率（B）、抗體融合蛋白表達（C）及氨濃度（D）情況

圖2是不同氨濃度條件下的CHO細胞生長、細胞活率、抗體融合蛋白表達以及維持期氨濃度的情況。首先由圖2-A可知，培養前期細胞快速生長，至培養第5天時達到最高活細胞密度為（7.88±0.32）×106cells/mL。此后細胞進入維持期，培養第5-9天活細胞密度不變。培養第9天以后活細胞密度開始緩慢下降，至培養結束時，對照組的活細胞密度為（7.02±0.11）×106cells/mL。由圖2-B可知，在細胞生長期以及維持期的前3天（培養第0-8天），細胞活率較高（＞98%）。培養第8天以后細胞活率開始緩慢下降，至培養結束時，對照組的細胞活率為90.96±0.95%。盡管通過氯化銨的添加使細胞維持期的氨濃度分別升高了2、4和6 mmol/L，氨濃度最高達到 12.08±0.28 mmol/L（圖2-D），但培養結束時的活細胞密度和細胞活率與對照組相比均沒有顯著差別。由此可見，細胞維持期氨濃度升高（＜12 mmol/L）對細胞維持和最終活率沒有影響，至培養結束時4個條件下的細胞活率均大于90%。

圖3是不同氨濃度條件下培養結束時的細胞形態，由圖可知，4組條件下細胞形態較為接近。表1總結了培養結束時的平均細胞直徑，由表可知，4組條件下均沒有顯著差異，可見維持期氨濃度在5-12 mmol/L范圍內對細胞大小沒有影響。此外，本研究進一步分析了培養結束時的凋亡細胞比例，圖4為不同氨濃度條件下培養結束時凋亡細胞比例的流式檢測圖，圖譜的右上方和右下方分別為晚期凋亡和早期凋亡的細胞及其占總細胞的比例，由圖可知，4組條件下培養結束時的晚期凋亡細胞和早期凋亡細胞分布較為接近，總凋亡比例較低（＜3%）。經計算，4組條件下的凋亡細胞比例沒有顯著差異（表1），可見維持期氨濃度在5-12 mmol/L范圍內對細胞凋亡也沒有影響。

圖3 不同氨濃度條件下培養結束時的細胞形態（白圈標記為死細胞）

表1 不同氨濃度條件下培養結束時的平均細胞直徑和凋亡比例

抗體融合蛋白表達方面，由圖2C可知在細胞生長期，抗體融合蛋白的表達量只有130.50±23.35 mg/L。進入細胞維持期后，抗體融合蛋白開始大量表達，至培養結束時對照組抗體融合蛋白的表達量達到1 152.31±22.23 mg/L。其中細胞維持期抗體融合蛋白的表達量為1 021.81±22.67 mg/L，占培養過程中總表達量的比例高達88.67%，因此這一培養階段也稱為產物表達期。培養結束時氨濃度升高2 mmol/L條件下的抗體融合蛋白表達量不變，而升高4和6 mmol/L條件下的抗體融合蛋白表達量分別只有對照組的 90.22%（P＜0.05）和 82.65%（P＜0.05）。可見隨著氨濃度的升高（＞9 mmol/L），抗體融合蛋白的表達量逐漸降低。由于培養過程的最終產物表達量是IVCC和產物比生成速率的乘積，而4個條件下的IVCC沒有差異（表2），因此抗體融合蛋白表達量的降低是比生成速率的減少導致的。經計算，在氨濃度升高4和6 mmol/L條件下，抗體融合蛋白的比生成速率比對照組顯著減少了9.88%和17.72%（P＜0.05）。

圖4 不同氨濃度條件下培養結束時凋亡細胞比例的流式檢測圖

表2 不同氨濃度條件下的IVCC和抗體融合蛋白的比生成速率

以上結果表明，細胞維持期氨濃度在5-12 mmol/L范圍內對CHO細胞的維持、培養結束時的細胞活率、形態以及凋亡比例沒有影響，但當氨濃度超過9 mmol/L時，抗體融合蛋白的表達能力開始下降。

2.2 氨濃度升高對CHO細胞代謝的影響

圖5是不同氨濃度條件下細胞維持期主要營養物葡萄糖和谷氨酰胺的消耗以及主要代謝副產物乳酸和氨的累積情況。由圖5-A可知，細胞維持期對照組的葡萄糖和谷氨酰胺比消耗速率分別為0.66±0.03 pmol/cell/day 和 0.10±0.01 pmol/cell/day，其它3組氨濃度升高條件下的葡萄糖和谷氨酰胺比消耗速率與對照組相比沒有顯著差異。

乳酸是葡萄糖代謝的主要副產物。由圖5-B可知，在細胞生長期（培養0-5 d），乳酸濃度累積至24.21±0.60 mmol/L。細胞維持期細胞繼續分泌乳酸，至培養結束時對照組的乳酸濃度達到29.34±0.41 mmol/L，共生成了5.13±0.86 mmol/L（圖5-C），這一階段的乳酸比生成速率為0.11±0.02 pmol/cell/day（圖5-D）。氨是細胞消耗谷氨酰胺所產生的主要代謝副產物，由圖2-D可知，細胞維持期氨持續生成，對照組的氨生成量為1.70±0.18 mmol/L（圖5-C），這一階段的氨比生成速率為0.036±0.004 pmol/cell/day（圖5-D）。與對照組相比，其它3組氨濃度升高條件下無論是乳酸和氨的總生成量，還是兩者的比生成速率均沒有顯著變化。

以上結果表明，細胞維持期氨濃度升高（＜12 mmol/L）對CHO細胞的葡萄糖和谷氨酰胺的消耗以及乳酸和氨的生成均沒有產生影響。

2.3 氨濃度升高對抗體融合蛋白的N-糖鏈結構以及唾液酸含量的影響

糖基化是抗體類藥物的關鍵質量屬性之一，糖基化的有效控制與最終藥物的臨床安全性和有效性密切相關。圖6為不同氨濃度下培養結束時抗體融合蛋白的4種主要N-糖鏈結構（唾液酸化、半乳糖化、巖藻糖化和高甘露糖）的比例。唾液酸（Sialic acid）位于N-糖鏈的末端，唾液酸化比例是指N-糖鏈中所有含唾液酸的糖鏈所占的比例（圖1）。由圖6-A可知，氨濃度升高導致培養結束時抗體融合蛋白的唾液酸化比例顯著降低。其中，氨濃度僅升高2 mmol/L就能導致唾液酸化比例從15.49±1.21%顯著降低到12.30±0.65%（P＜0.05），且隨著氨濃度的升高，抗體融合蛋白的唾液酸化比例會繼續降低。

半乳糖化比例是指N-糖鏈中所有含半乳糖（Galactose）的糖鏈所占的比例（圖1）。由于半乳糖的連接是唾液酸加工至N-糖鏈上的前提，半乳糖化程度會直接影響最終N-糖鏈的唾液酸化程度。由圖6-B可知，對照組培養結束時抗體融合蛋白的半乳糖化比例為51.41±0.67%，在氨濃度升高2、4和6 mmol/L條件下，抗體融合蛋白的半乳糖化比例分別只有46.50±1.15%、42.59±0.85%和41.04±0.41%。可見隨著氨濃度的升高，抗體融合蛋白的半乳糖化比例也在不斷降低。

巖藻糖化比例是指N-糖鏈中所有含巖藻糖（Fucose）的糖鏈所占的比例（圖1）。高甘露糖是N-糖基化過程早期形成的末端含有多個甘露糖（Mannose）的不完整糖型，在圖1所示的抗體融合蛋白的N-糖鏈結構中，高甘露糖比例特指Man5糖型的比例。由圖6-C可知，培養結束時抗體融合蛋白的大部分N-糖鏈（＞70%）含有巖藻糖，氨濃度升高對巖藻糖化比例沒有明顯影響。而圖6-D顯示，培養結束時抗體融合蛋白的Man5比例較低（＜3%），氨濃度升高條件下Man5比例沒有發生改變。

圖5 不同氨濃度條件下細胞維持期的葡萄糖和谷氨酰胺的比消耗速率（A）、乳酸濃度（B）、乳酸和氨的生成（C）以及乳酸和氨的比生成速率（D）情況

抗體融合蛋白的唾液酸含量是指導最終產品放行的關鍵質量指標之一。圖7為不同氨濃度下培養結束時抗體融合蛋白的唾液酸含量。可以看出，隨著氨濃度的升高，培養結束時抗體融合蛋白的唾液酸含量不斷降低。在氨濃度升高2、4和6 mmol/L條件下，抗體融合蛋白的唾液酸含量分別只有對照組的92.06%，86.64%和83.97%。氨濃度的升高量與最終抗體融合蛋白的唾液酸含量具有較好的負相關性（R2=0.953 6）。

3 討論

運用動物細胞培養技術生產抗體類藥物已成為當今生物制藥行業的主流趨勢。隨著細胞株構建、培養基開發以及過程優化技術的不斷進步，細胞生長和產物表達水平明顯提高，同時培養環境也更為復雜。其中代謝副產物氨的累積會對細胞產生毒副作用，導致細胞生長與代謝、產物表達和糖基化過程受到影響［13-15］。由于細胞密度和代謝水平的不同也會影響產物表達和糖基化過程［16-17］，因此本研究系統考察了在培養前期細胞密度和代謝水平相同的條件下，氨濃度升高對細胞維持期CHO細胞維持、細胞代謝、抗體融合蛋白的表達以及N-糖鏈結構的影響。

細胞的諸多生理代謝反應如糖酵解和磷酸戊糖途徑在胞漿進行，氨能通過擴散作用進入細胞，使胞漿pH異常升高，導致細胞的代謝反應受到影響，進而影響細胞的生理狀態［9，14］。研究表明，在初始細胞培養時提高氨濃度至超過5 mmol/L后，細胞的比生長速率和最高活細胞密度減少［13，21］。由于在實際培養過程中氨是持續生成的，培養前期的氨濃度往往較低，而在產物大量合成的細胞維持期氨濃度才會較高。因此，細胞維持期氨對過程結果的影響更應該被關注。本研究發現，細胞維持期氨濃度在5-12 mmol/L范圍內對CHO細胞的維持、培養結束時的細胞活率、形態以及凋亡比例沒有影響。可見氨對不同培養階段細胞的影響是不同的。

圖6 不同氨濃度條件下培養結束時抗體融合蛋白的唾液酸化比例（A）、半乳糖化比例（B）、巖藻糖化比例（C）以及高甘露糖比例（D）

圖7 不同氨濃度條件下培養結束時抗體融合蛋白的唾液酸含量

產物的最終表達量是IVCC和產物比生成速率共同決定的［22］。在維持細胞密度相同的情況下，細胞的最終活率將直接影響IVCC。此外，細胞需要消耗大量葡萄糖和谷氨酰胺為產物合成提供能量［23］。因此在維持細胞密度相同的條件下，抗體融合蛋白的最終表達量與細胞的維持情況和代謝水平密切相關。本研究發現細胞維持期氨濃度維持在5-12 mmol/L時，雖然CHO細胞的維持情況、葡萄糖和谷氨酰胺的消耗以及副產物乳酸和氨的生成沒有受到影響，但當氨濃度超過9 mmol/L時，抗體融合蛋白的比生成速率顯著減少，導致最終表達量顯著降低。此外，有文獻報道［13，15］，當氨濃度超過10 mmol/L后，最終產物的表達量降低。由于這些研究是在初始細胞培養時提高氨的濃度，對培養前期的細胞生長也造成影響，導致IVCC下降。在本研究中，相同的IVCC更能體現氨對細胞表達產物能力的負作用。

抗體類藥物的唾液酸化程度、高甘露糖糖型比例、半乳糖化程度和巖藻糖化程度分別與藥物的循環半衰期、補體依賴的細胞毒性（Complementdependent cytotoxicity，CDC）和抗體依賴的細胞毒性（Antibody dependent cell cytotoxicity，ADCC） 等臨床表現相關［24］。產物的糖基化過程控制是生物制藥界面臨的難題之一。研究表明，氨能通過擴散作用進入高爾基體，擾亂其正常的pH環境，使重要的功能酶（如糖基轉移酶）的作用受到影響，最終導致產物的糖鏈結構發生變化［12，25］。本研究發現隨著細胞維持期氨濃度的升高，抗體融合蛋白的半乳糖化程度和唾液酸化程度均不斷降低，而巖藻糖化程度和高甘露糖糖型比例則沒有發生變化，明確了氨影響糖基化過程的作用位點。與蛋白表達過程相比，糖基化過程對氨更為敏感，氨濃度超過5 mmol/L就能導致抗體融合蛋白的糖基化過程受到影響。此外，Yang等［13］發現，當氨濃度超過5 mmol/L后，最終產物的糖基化程度降低。Hoog等［21］同樣發現，當氨濃度超過5 mmol/L后，最終產物的半乳糖化程度降低，但其它糖鏈結構的比例則沒有變化。然而，這些研究仍是在初始培養時提高氨的濃度，導致培養前期的細胞生長、細胞對營養物的消耗以及代謝副產物的生成情況改變，而細胞密度以及代謝水平的差異也可能會影響糖基化加工。在本研究中，由于實驗排除了維持細胞密度和細胞代謝水平對糖基化過程的影響，結果更直觀地體現了氨對糖基化過程的作用。

產物的高效表達是細胞培養過程建立的首要目標。而糖基化是抗體類藥物的關鍵質量屬性之一，各國藥品監管機構均要求對抗體類藥物的糖鏈結構進行嚴密的控制［2］。氨作為高密度細胞流加培養過程中累積的主要代謝副產物之一，會直接影響產物表達和糖基化過程。因此，正確認識氨對產物表達和糖基化過程的作用，同時結合藥物的作用機制和具體的糖基化控制要求設定合理的氨濃度控制區間，對運用質量源于設計（Quality by design，QbD）方法建立高效的細胞培養過程及其后續的過程放大策略具有重要的指導意義。

4 結論

本研究考察了細胞維持期氨濃度升高對CHO細胞維持、細胞代謝、抗體融合蛋白表達和N-糖基化的影響。結果表明，氨濃度升高（5-12 mmol/L）對CHO細胞的維持、葡萄糖和谷氨酰胺的消耗以及副產物乳酸和氨的生成情況沒有明顯影響，但不利于抗體融合蛋白的表達和N-糖基化過程。氨濃度大于5 mmol/L即可對抗體融合蛋白的半乳糖化程度和唾液酸化程度產生不利影響，但氨濃度升高對巖藻糖化程度和高甘露糖糖型比例沒有作用。而當氨濃度升高至大于9 mmol/L后，抗體融合蛋白的比生成速率開始顯著減少，導致最終表達量顯著降低。