戈壁異常球菌角蛋白酶基因的克隆及功能研究

耿秀秀 周正富 劉盈盈 平淑珍 王勁

（1. 西南科技大學生命科學與工程學院，綿陽 621000；2. 中國農業科學院生物技術研究所，北京 100081）

角蛋白是非營養型的硬蛋白［1］，起到保護機體的作用［2］。β角蛋白存在于鳥禽的羽毛中，因此又被稱為羽毛角蛋白［3］。隨著畜牧養殖業為我們提供大量肉制品的同時也產生大量毛發、羽毛和蹄等難降解物質。傳統方法（填埋、焚燒）處理這些物質不僅占據大量空間污染環境還浪費蛋白質資源［4］。角蛋白酶（Keratinase，Ker）是專一水解角蛋白且對環境友好的一類酶［5］，1899年，Ward首次報道了一株能降解角蛋白的細菌——真菌馬甲團囊菌［6］；1990年，Williams等［7］報道了一株能夠降解羽毛的地衣芽孢桿菌 PWD-1；1993年，Atalo和 Gashe［8］得到了一株能夠降解多種纖維性蛋白的嗜熱桿菌，丁正民［9］分離純化得到一株能夠降解雞毛的放線菌株SS-1；1996年，Frederich等［10］分離得到一株能夠利用羽毛角蛋白的嗜熱厭氧菌閃光桿菌，同年Santos等［11］發現了能夠降解角蛋白的曲霉；1999年，Chitte等［12］得到一株能夠高效降解角蛋的放線菌株嗜熱鏈霉菌，Wang等［13］利用基因工程的手段表達了重組角蛋白酶。目前，角蛋白酶的研究主要集中在利用基因工程篩選并生產高酶活的角蛋白酶［14］。

自然界中很多菌屬都含有角蛋白酶基因［15］，如：耐輻射異常球菌屬的小球菌（Deinococcus radioduransR1）和戈壁異常球 菌（D. gobiensisI-0）。R1是Anderson 等（1956年）在俄勒岡州經大劑量輻射滅菌仍然腐爛變質的肉類罐頭中分離獲得的一種微小球菌，備受生物界、環境工程界和醫學界關注［16-17］。I-0是本實驗室從新疆戈壁沙漠環境中分離到的極具輻射抗性的微生物，比較基因組學分析發現，戈壁異常球菌與耐輻射異常球菌在系統進化上屬于同一進化分支，兩者均為異常球菌屬。生物信息學分析顯示，戈壁異常球菌I-0基因組中Dgo_RS02895基因編碼的蛋白與peptidases_s8_s53蛋白家族序列具有一定相似性。本研究克隆Dgker蛋白基因，并進行外源表達與純化，探索它對羽毛的降解能力，旨在獲得高比活的角蛋白酶。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及培養基 野生型戈壁異常球菌（D.gobiensisI-0）為本實驗室保存；高頻轉化受體菌大腸桿菌E. coliTop10及表達菌株E. coliBL21（DE3）購自北京全式金生物技術有限公司；原核表達載體pET22b購自北京全式金生物技術有限公司。大腸桿菌于LB培養基（1% Typtone，0.5% Yeast extract，1%NaCl，pH 7.0，固體培養基含 1.5% 瓊脂）中 37℃ 培養。

1.1.2 主要試劑 常規質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購自Magen公司；BSA、限制性內切酶購于 New England Biolabs公 司；PrimeSTAR HSDNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、T4 DNA 連接酶、2k plusⅡmarker 購自北京全式金生物技術有限公司；Western blot化學發光試劑購自碧云天生物技術有限公司。引物合成和基因測序均由華大基因完成。

1.2 方法

1.2.1 Dgker蛋白生物信息學分析 從NCBI中獲取戈壁異常球菌Dgo_RSO2895基因的序列及所編蛋白的氨基酸序列信息。通過Compute pI/Mw tool（http：//web.expasy.org/compute_pi/）對戈壁菌角蛋白酶蛋白的分子質量和等電點進行預測；使用http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/網站在線預Dgker 蛋白的二級結構，通過 SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/Services/SignalP/）預測信號肽；利用 TMHMMServer v.2. 0（http ：//www. cbs. dtu.dk/services/TM-HMM/）預測跨膜結構域。

1.2.2 Dgker重組E.Coli菌株的構建 根據目的基因Dgker的序列及表達載體 pET-22b（+）的多克隆位點，利用 Oligo 7 軟件設計基因擴增特異性引物Dgker-F（5'-ACCGGATCCGATGAACGGAGTCTTACCCT-3'，下劃線處為BamH Ⅰ 酶切位點）和Dgker-R（5'-ACC CTCGAGGAAGTTCAGGGTGTACAGCA-3'，下劃線處為XhoⅠ 酶切位點），引物序列由北京擎科生物股份有限公司合成。

采用試劑盒提取戈壁異常球菌I-0基因組DNA，測定其濃度及純度后，以此為模板，用已合成的引物Dgker-F和Dgker-R進行PCR擴增。將 PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測。將目的條帶膠塊用凝膠回收試劑盒回收。PCR擴增體系（50 μL）：5×PrimeSTAR Buffer（Mg2+Plus）10 μL ；2.5 mmol/L dNTP Mixture 4 μL；10 μmol/L 上、 下 游 引 物 各 2 μL ；200 ng/μL DNA 模板 2 μL ；2.5 U/μL PrimeSTAR HSDNA 聚合酶 0.5 μL；加 ddH2O 至總體積 50 μL。PCR反應條件：95℃變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火35 s，72℃延伸1.5 min，共30個循環；72℃延伸5 min。

將上步回收獲得的 PCR 產物與載體 pET-22b質粒分別用限制性內切酶BamH Ⅰ和XhoⅠ 37℃酶切3 h，用1%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產物并回收目的基因及載體的DNA片段，隨后用T4 DNA

Ligase連接，轉化E. colitop10感受態細胞，獲得陽性克隆菌落。運用質粒提取試劑盒提取質粒，隨后進行雙酶切鑒定，將驗證正確的質粒交由北京六合華大基因科技有限公司測序。將測序正確的重組質粒，轉化表達菌株BL21（DE3）獲得重組菌株BL21（pET22b-Dgker）。

1.2.3 重組E.coli菌株誘導表達 將實驗的重組菌株以及對照菌株在LB平板上分別劃線過夜培養，從活化的平板上分離單菌落，接種于20 mL含有氨芐抗生素的LB培養基，過夜培養作為母液，將母液以1%的接種量加入到100 mL含有氨芐抗生素的LB培養基配養2 h左右OD600達到0.6-0.8加IPTG使終濃度為0.3 mmol/L誘導，37℃誘導4 h。

1.2.4 重組E.coli菌株功能試驗 將實驗的重組菌株以及對照菌株在LB平板上分別劃線過夜培養，從活化的平板上挑取單菌落，接種于20 mL含有氨芐抗生素的LB培養基過夜培養作為母液。將母液以1%的接種量加入到10 mL含有氨芐抗生素的羽毛培養基中37℃ 220 r/min培養，同時把菌液點在含脫脂奶粉的平板上37℃培養，觀察有無降解圈以及降解圈的變化。

1.2.5 羽毛粉為底物酶活力的測定 參照蔡成崗［18］測定角蛋白酶酶活方法，略有改動：實驗組10 mg羽毛粉與2 mL Tris-HCl（50 mmol/L pH8.5）混勻，加入1 mL粗酶液30℃反應1 h后加入2 mL10%三氯乙酸（TCA）終止反應；冰浴10 min，10 000 r/min離心10 min，取上清紫外分光光度計測定280 nm處吸光值。空白組10 mg羽毛粉與2 mLTris-HCl（50 mmol/L pH8.5）混勻，加入1 mL粗酶液和2 mL10%三氯乙酸（TCA）30℃反應1 h后終止反應；冰浴10 min，10 000 r/min離心10 min，取上清紫外分光光度計測定280 nm處吸光值。

1.2.6 角蛋白酶最適溫度和最適pH的測定 用pH8.5的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液混合底物，在不同溫度（20-80℃）下搖床振蕩反應1 h測Dgker的酶活力，由結果繪制最適溫度曲線。以pH4.0-11.0的緩沖液混合羽毛粉底物，在60℃水浴反應1 h測Dgker的酶活力，根據測定結果繪制Dgker的最適pH曲線。

2 結果

2.1 Dgker蛋白生物信息學分析

通過分析戈壁異常球菌基因組發現，Dgo_RS02895位于D. gobiensisI-0染色體上，Dgker由412個氨基酸組成，分子量為41.17 kD，等電點（pI）為6.07。在線預測Dgker蛋白的二級結構，多以α螺旋和卷曲結構存在，對該蛋白和來自B.licheniformisPWD-1的Ker A蛋白保守性分析，結果顯示前50左右的氨基酸（圖1-A紅色框內）與跨膜結構有關，成熟蛋白區（圖1-A紅色括號內）有3個主要氨基酸分別是171位的天冬氨酸、203位的組氨酸、358位的絲氨酸。氨基酸序列預測圖表明該蛋白前端有一段序列形成前導肽（圖1-B），跨膜結構分析結果還顯示該蛋白存在跨膜結構（圖1-C），另外對該蛋白的三級結構進行模擬（圖1-D），結果顯示前50左右的氨基酸并沒有參與主結構的形成，主結構是從第51個氨基酸開始和模型相似。

2.2 構建pET-22b-Dgker表達載體

以提取的耐輻射異常球菌基因組DNA為模板PCR擴增目的基因，獲得的條帶大小與預期一致約為1 239 bp（圖2-A）。將回收產物連接pET-22b后轉化到E. coliTOP10獲得pET-22b-Dgker重組菌株，對重組菌株提取質粒進行雙酶切驗證（圖2-A），重組質粒8 000 bp左右，雙酶切得到一條1 300 bp左右的目的條帶和一條大于5 000 bp的載體片段。同時送公司進行測序，結果證明目的基因已經成功連入表達載體。

對Dgker蛋白進行誘導表達，經親和層析過柱純化，獲得純化后的蛋白。SDS-PAGE分析結果（圖2-B）顯示，以僅含空載體pET22b的大腸桿菌和未誘導的重組菌為對照，0.3 mmol/L IPTG誘導下出現1條與Dgker蛋白大小（41.1 kD）吻合的條帶（圖2-B中黑色箭頭所指）。

2.3 Dgker降解羽毛實驗

以OD 0.1轉接種子液于加入羽毛的LB培養基中培養，觀察記錄到重組菌株在3 d左右的時間里把羽毛分解（圖3-A），同時在奶粉培養基上誘導表達獲得的重組菌株粗酶液、空載菌株粗酶液出現降解圈的時間同步（圖3-B），對比可知含角蛋白基因的重組菌株粗酶液降解能力比空載菌株強，說明角蛋白基因有作用。

圖1 Dgker序列分析和結構預測

2.4 Dgker酶活最適溫度和pH實驗

用pH8.5的緩沖液，分別在20、30、40、50、60、70和80℃下，測定Dgker酶活力。如圖（4-A）所示，Dgker的最適溫度是60℃，當溫度從20℃上升到60℃時，Dgker的酶活隨之有上升的趨勢，60℃到80℃酶活隨溫度升高而降低；溫度在30-50℃之間酶活比較穩定，有利于在工業上應用推廣。在60℃條件下，分別在pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的緩沖液測定Dgker酶活力。由圖4-B可知，Dgker的最適pH是5.0，pH從4.0上升到5.0時，酶活有個上升的過程，pH5.0-pH9.0酶活呈變化狀態總趨勢是下降。

3 討論

圖2 Dgker驗證及純化圖

圖3 Dgker降解羽毛圖

圖4 Dgker在不同溫度、pH下的酶活圖

Dgker蛋白是相對分子量在30-50 kD的酶類，對羽毛有一定的分解作用、對頭發和蹄分解作用不明顯。本研究通過生物信息學分析發現Dgker蛋白分子量為41.1 kD與耐輻射異常球菌的蛋白親緣關系最近且與同屬蛋白具有較高的序列相似性，是一個異常球屬特異性蛋白。異常球屬微生物可以在極端環境中生存，其擁有非凡的適應機制以抵抗極端環境造成的損傷。Dgker來源于戈壁異常球菌，該菌分離于戈壁沙漠，推測其可能更耐酸堿及高溫，對羽毛處理有重要作用。

目前為止，有關角蛋白酶的研究多集中在篩選新菌株［19-20］、發酵和處理條件優化［21-22］、基因工程等方面，研究表明角蛋白酶能破壞角蛋白中的二硫鍵［23］和肽鍵，可以在動物飼料加工和皮革制品鞣制過程中發揮重要作用［24］。本研究從戈壁異常球菌中克隆了一個新的角蛋白酶編碼基因，氨基酸序列前段有前導肽與Wu等［15］在文章中分析的一致，并且在相似的位置形成跨膜結構域，此結構的存在對于蛋白的純化有一定的影響。模擬Dgker的三維結構時還發現這個區域的氨基酸沒有參與主結構的模擬，在后續實驗中可以考慮把它們突變掉觀察酶活性變化，用來提高生產效率。對Dgker和kerA蛋白保守性分析結果顯示有很相似的區域如前導肽、成熟蛋白區都沒有尾巴結構（C-terminal propeptide［15］），成熟蛋白區都有 3 個主要的氨基酸（Asp、His、Ser）在水解角蛋白時發揮作用。通過大腸桿菌原核表達系統進行表達并純化后的蛋白經檢測具有角蛋白水解活性，該菌株以后可以用于處理廢棄羽毛等，為進一步發掘工業用角蛋白酶提供了基因資源。實驗得出Dgker粗酶液酶活最適溫度是60℃，此溫度比B.licheniformisPWD-1生長溫度45-50℃［7］更耐高溫，該蛋白又是在大腸桿菌中表達方便培養利于生產。Dgker的最適pH是5.0與已知的大多數蛋白酶最適的值在7.5-10之間相比該蛋白更耐酸有利于生產成本的降低。該基因編碼的前50個氨基酸對Dgker的影響將在接下來的工作中進行探索［25］，同時將進一步研究Dgker在工業上的應用前景。

4 結論

本研究確定了戈壁異常球菌（D. gobiensisI-0）中Dgo_RS02895基因編碼的蛋白與peptidases_s8_s53 家族蛋白相似，是角蛋白酶的一種，命名為Dgker。成功構建了表達 Dgker 的重組菌株E. colipET22b-Dgker/BL21，降解羽毛實驗表明Dgker有降解羽毛的功能。粗蛋白的酶活測定結果表明 Dgker酶活最適溫度在60℃，最適pH是5.0。