海洋生物共附生真菌的分離、鑒定及抗菌活性分析

張圣良 楚肖肖 趙友興 孔凡棟 黃小龍

（1. 海南大學熱帶農林學院，海口 570100；2. 中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所，海口 570100）

海洋微生物是海洋天然產物的主要來源之一。尤其是海洋真菌，遺傳背景復雜、代謝產物種類豐富，已成為海洋微生物新天然產物挖掘的重要資源［1］。據不完全統計，海洋真菌產生結構類型多樣的新天然產物，包括萜類、聚酮類、肽類、甾體、酰胺、脂肪酸、生物堿等。這些新天然產物呈現出包括抗菌、抗腫瘤、抗寄生蟲、抗污損和抗病毒等多種生物活性［2］，引起了國內外眾多天然產物研究者的廣泛關注。

海洋真菌分布廣泛，棲息于海洋的各種生態環境，包括海水、海底沉積物、海水漂浮木、海洋動植物表面及內部組織等［3］。其中，海洋動植物是海洋真菌的良好宿主，海洋真菌與這些宿主形成了附生、共生或者內生的相互關系，這種相互影響不僅使海洋真菌產生與其他海洋真菌不一樣的次級代謝產物，甚至還有可能產生與宿主相同或相似的活性物質［4］。因此，近年來海洋共附生真菌已成為海洋微生物天然產物研究的熱點［5-6］。

海綿、珊瑚和海草是海洋底棲生長的主要動植物種類，是海洋生態系統中的重要生物種群，蘊含著豐富的共附生真菌資源，并能產生豐富的次級代謝產物［7-8］。因此，對這三種海洋生物的共附生真菌種類進行廣泛深入地分離和研究，不僅對海洋環境的生態保護具有重要意義，也對發現與挖掘新的活性天然產物具有重要的利用價值。基于此，本研究采集海南文昌近海域的海綿、石珊瑚和海草為研究對象，對其共附生真菌進行分離、鑒定和抗菌活性分析，旨為這類海洋共附生真菌資源的進一步開發和利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 海草、海綿、石珊瑚樣品采集于海南文昌海域。樣品采集后，4 h內帶回實驗室-20℃冰箱保存備用。抗菌活性指示菌：金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌為實驗室保存。

1.1.2 培養基配置 分離培養基Ⅰ：麥芽提取粉，20 g；陳海水，1 L；自然pH；瓊脂，20 g。分離培養基Ⅱ：葡萄糖，10 g；蛋白胨，5 g；KH2PO4，1 g；MgSO4·7H2O，0.5 g；陳海水，1 L；自然pH；瓊脂，20 g。分離培養基Ⅲ：蛋白胨，5 g；葡萄糖10 g；磷酸二氫鉀1 g；硫酸鎂0.5 g；瓊脂15 g；孟加拉紅0.03 g；蒸餾水1 000 mL；氯霉素0.1 g。抑制劑：100 mg/L的羧芐青霉素和鏈霉素（加入所有分離培養基中）。2號發酵培養基：麥芽提取粉，20 g；葡萄糖，20 g；酵母膏，5 g；蛋白胨，10 g；陳海水，1 L；自然pH。4號發酵培養基：甘露醇，20 g；葡萄糖，20 g；酵母膏，5 g；蛋白胨，10 g；KH2PO4，0.5 g；MgSO4·7H2O，0.3 g；陳海水，1 L；pH6.0。

1.2 方法

1.2.1 真菌菌株分離 將采集的海草、海綿和石珊瑚樣品分別用無菌水清洗三次，剪碎，取1 g置于無菌研缽中，加5 mL無菌水研磨成勻漿，吸取上清液按1∶10、1∶100、1∶1 000的比例稀釋，取稀釋液100 μL分別涂布于分離培養基上，28℃，培養3-5 d，挑取單菌落到PDA培養基上，反復純化。純化后的菌株分別保存于PDA斜面和-20℃的無菌甘油（20%）。

1.2.2 真菌菌株鑒定 純化得到的菌株根據平板上的形態特征進行初步排重，選取形態特征差異較大的菌株做ITS序列分析。各菌株基因組DNA 提取及 rDNA-ITS 擴增參照陳吉良［9］等 的方法。即取0.2 mL 10%（W/V）的Chelex-100 溶液加入到無菌的離心管中，再從平板上挑取綠豆大小的菌絲體置于Chelex-100 溶液中，在旋渦混合器上振蕩4-5 s至菌株與溶液混合，然后沸水浴10 min；冷卻至室溫之后，10 000 r/min離心10 min。取上清作為PCR擴增的模板，PCR引物為ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。擴增產物送往上海生物工程有限公司進行測序。所得序列利用NCBI中BLAST在線比對服務進行同源性比較分析，并確定菌株的種屬。

1.2.3 真菌菌株抗菌活性分析 分別接種菌株于發酵培養基2號和4號中靜止常溫下培養30 d，三倍體積乙酸乙酯萃取3次，萃取液合并后經減壓旋蒸濃縮得粗提物。將粗提物用甲醇配制成1 mg/mL濃度，10 000 r/min離心10 min。取10 μL的上清液加在直徑為6 mm 的濾紙片上，待濾紙片風干后，貼在已分別接種了金黃色葡萄球菌和枯草桿菌的瓊脂營養培養基表面（菌體濃度1×106/mL），28℃培養1 d，采用十字交叉法測定抑菌圈直徑，重復3次。

2 結果

2.1 真菌的分離純化

本研究共采用了3種分離培養基對采集于海南文昌海域的10種海草、9種海綿和11種石珊瑚的共附生真菌進行分離純化，一共獲得了113株純化的真菌。其中海綿中分離得到的菌株最多，為53株真菌，占比46.9%；石珊瑚次之，為42株真菌，占比37.2%；海草最少，為18株真菌，占比15.9%（圖 1）。

圖1 3種海洋生物中分離的共附生真菌所占比例

2.2 真菌的多樣性分析

通過形態排重，選取32株代表性菌株進行了ITS序列分析。結果（表1）表明，32株真菌歸屬于3個門（子囊菌門、擔子菌門和半知菌門），8個目（叢梗孢目、曲霉目、絲孢目、殼霉目、盤菌目、球殼目、刺盾炱目和多孔菌目）和10個屬（枝孢屬、曲霉屬、地霉屬、青霉屬、擬青霉屬、籃狀菌屬、彎孢聚殼屬、偽壺擔菌屬、小囊菌屬和隔孢伏革屬），以及1個未定屬的炭角菌科。

其中9株菌屬于曲霉屬（Aspergillus），6株菌屬于地霉屬（Geotrichum），4株菌屬于彎孢聚殼屬（Eutypella），2株菌屬于枝孢屬（Cladosporium），1株屬于隔孢伏革屬（Peniophora），2株菌屬于青霉屬（Penicillium），1株菌屬于籃狀菌屬（Talaromyces），1株屬于小囊菌屬（Microascus），1株菌屬于擬青霉屬（Paecilomyces），1株菌屬于偽壺擔菌屬（Pseudolagarobasidium），1株屬于炭角菌科（Xylariaceae），1株屬于多孔菌目（Polyporales），2株屬于刺盾炱目（Chaetothyriales）。海綿樣品中分離的真菌種類最豐富，10個屬的真菌都有分布。而石珊瑚和和海草樣品中分離到的真菌種類最少。此外，曲霉屬真菌分離率最高，其他種屬則較低。

2.3 真菌發酵產物的的抗菌活性

采用兩種培養基對分離的真菌進行靜置發酵，并分別提取發酵產物進行抑菌活性分析。結果（表2）發現有12株真菌對兩種指示細菌顯示出不同程度的抑菌作用，并且在不同發酵培養基條件下對真菌代謝產物的抑菌能力產生一定的影響。其中，菌株 HNMF055、HNMF085、HNMF093和 HNMF095在2號發酵培養基上對枯草芽孢桿菌的抑制活性相對較強。在4號發酵培養基上，菌株HNMF067和HNMF075則對枯草芽孢桿菌具有很強的抑制效果。而菌株HNMF073和 HNMF061和HNMF093在兩種發酵培養基對枯草芽孢桿菌都表現出較強的抗性。此外，菌株HNMF067、HNMF055、HNMF085、HNMF088和HNMF103對金黃色葡萄球菌具有抑制作用，其中菌株HNMF088的抑制效果最強。

3 討論

本研究從海南文昌海域采集的海綿、石珊瑚和海草樣品中共分離到113株海洋真菌，鑒定了32株獨立的真菌。其中曲霉屬真菌是所有樣品分離率最高的類群，這與前人的報道一致［10-15］。海綿樣品中除了分離到常見的Aspergillus屬和Penicillium屬真菌外，還分離出不常見的Cladosporium、Microascus、Paecilomyces、Talaromyces和 Xylariaceae， 以 及未 見 報 道 的Geotrichum、Eutypella、Peniophora、Pseudolagarobasidium等真菌。海草和石珊瑚樣品中除了常見的Aspergillus屬真菌，也發現不常見的Cladosporium屬和Talaromyces屬真菌。總體看來，這些海洋生物共附生真菌種類豐富多樣，寄主既有普遍性，又存在特異性。其中曲霉屬真菌的寄主分布廣泛，而其他屬真菌的寄主則具有一定的特異性。曲霉屬真菌不僅是海洋最常見的真菌種類之一，也是海洋新天然產物開發的重要資源。據統計，該屬真菌能產生物堿、聚酮、甾體、萜類、脂肪酸、鹵代物、糖苷、肽類等結構類型多樣的天然產物，并呈現出多種生物活性，包括抑菌、抗癌、抗寄生蟲和清除自由基等［16］，這些新天然產物正成為海洋藥物開發的先導化合物。例如，海洋曲霉屬真菌Aspergillus ustus的天然產物halimide的衍生物plinabulin（NPI-2358），作為一種新型的血管阻斷劑抗癌藥，目前已經進入了III期臨床研究［17-18］。而其他稀有類群海洋真菌的新天然產物在海洋真菌天然產物的研究中也占有重要地位［1］。因此，本研究分離到的113株海洋真菌中，既有常見的曲霉屬真菌種類，也有稀有的如Pseudolagarobasidium等真菌類群。目前還未見對該海域的海洋真菌的相關報道，預示這些共附生真菌在海洋天然產物的挖掘上具有潛在的利用價值。

表1 海草、海綿以及石珊瑚來源的32株真菌ITS序列的BLAST分析

此外，本研究采用兩種發酵培養基對分離菌株進行發酵培養，結果僅12株真菌的發酵產物表現出抗菌活性，且12株菌中大部分菌株的抗菌活性在兩種培養基呈現出較大差異，表明培養條件如培養基種類對海洋真菌代謝產物的表達具有重要影響。海洋真菌的次級代謝產物合成相關基因簇在實驗室條件下大部分處于沉默狀態，環境條件的改變能夠使得某些沉默的基因得以表達從而產生不同的次生代謝產物［19］。因此，其它未表現出活性的菌株可能與選用的培養基不適宜有關，有待進一步采用單菌株多次級代謝產物策略（One strain many compounds，OSMAC）［20］改變現有培養條件，激發沉默基因簇的表達，促使其產生更多結構新穎、生理活性好的次生代謝產物。

表2 海草、海綿和石珊瑚共附生真菌的發酵產物在不同培養基下的抑菌活性分析

總之，本研究對海南文昌海域的海草、海綿和石珊瑚共附生真菌的多樣性進行了初步探討，既分離到常見的曲霉屬真菌，也獲得比較稀有的其他真菌種類；通過抗菌活性初篩，部分真菌的發酵產物具有良好的抗菌活性，這為后續海洋真菌活性代謝產物的開發利用研究奠定了基礎。

4 結論

本研究從海南文昌海域采集的海綿、石珊瑚和海草樣品中共分離到113株海洋真菌，鑒定了32株獨立的真菌，32株真菌歸屬于3個門（子囊菌門、擔子菌門和半知菌門），8個目（叢梗孢目、曲霉目、絲孢目、殼霉目、盤菌目、球殼目、刺盾炱目和多孔菌目）和10個屬（枝孢屬、曲霉屬、地霉屬、青霉屬、擬青霉屬、籃狀菌屬、彎孢聚殼屬、偽壺擔菌屬、小囊菌屬和隔孢伏革屬），以及1個未定屬的炭角菌科。采用兩種發酵培養基對分離菌株進行發酵培養，結果僅12株真菌的發酵產物表現出抗菌活性，且12株菌中大部分菌株的抗菌活性在兩種培養基呈現出較大差異，表明培養條件如培養基種類對海洋真菌代謝產物的表達具有重要影響。