cART治療完全應答HIV-1感染者血漿外泌體對CD8+ T細胞的免疫調節作用及與CD4/CD8比值的相關性

楊 濤，周明菊，李華杰，黃輝煌，徐若男，施 明

自1981年在美國首次發現HIV-1以來，目前針對HIV-1感染的治療方案中，聯合抗反轉錄病毒治療（combination antiretroviral therapy, cART）的效果明確，使艾滋病逐漸轉變成慢性疾病。但HIV感染后過度的免疫活化和持續的炎癥反應很難通過cART得到有效逆轉，表現為艾滋病相關和非相關事件頻發[1]。cART可幫助患者免疫重建，恢復CD4+T細胞數量，但CD8+T細胞數量居高不下，導致CD4/CD8比值不能復常[2]。目前研究顯示，CD8+T細胞、CD4/CD8比值均應作為評估機體免疫功能的指標。尤其是CD4/CD8比值與機體過度的炎癥反應和免疫超活化密切相關[3-6]。CD4/CD8比值復常是一個非常緩慢的過程，越早開始cART（CD4+T細胞計數高），CD4/CD8復常相對越容易[7]。而除了CD4+T細胞的基線水平外，機體中可能還存在其他的免疫因素能夠影響CD4/CD8比值復常[6]。

外泌體存在于關節滑液、母乳、血液等體液中，介導細胞間核酸、蛋白質及脂質等生物活性分子的交換，從而影響受體細胞或親本細胞中的各種生理和病理過程。外泌體具有抗原遞呈功能，可以攜帶或遞呈主要組織相容性復合體-抗原復合物來調控抗原特異性CD8+T細胞的免疫應答[8-9]。在HIV感染過程中，外泌體既能保護機體免受病毒感染，又可增強HIV的感染能力[10-14]。已有研究證明外泌體可調節CD8+T細胞功能[15-17]。本研究擬探討HIV-1慢性感染者接受長期有效cART后的完全應答（complete response, CR）患者血漿中外泌體對CD8+T細胞的潛在作用，及其與CD4/CD8比值的關系，闡述外泌體與HIV感染者炎癥反應、持續免疫活化的關系，為艾滋病的臨床治療提供新的研究思路。

1 對象與方法

1.1 對象 納入2018年2—10月于中國人民解放軍總醫院第五醫學中心愛心門診隨訪的HIV-1慢性感染且接受長期有效cART的 CR患者19例。根據CD4/CD8比值將患者分為異常組（CD4/CD8＜0.8）10例和復常組（CD4/CD8＞0.8）9例。入組標準：參照中華醫學會感染病學分會《中國艾滋病診療指南（2018版）》[18]，入組HIV-1慢性感染的CR患者為接受cART 2年以上，血漿病毒載量持續2年以上低于檢測下限（20 copies/ml）， CD4+T細胞計數＞ 350個/μl。排除標準：①當前存在機會性感染；②合并HBV或者HCV等其他病毒感染；③妊娠期婦女或產褥期婦女；④患有精神類疾病或其他嚴重疾病患者。另以同期5例健康者作為健康對照（healthy control, HC）組。上述研究對象均簽署知情同意書，其基本特征見表1。

1.2 方法

1.2.1 血漿外泌體的提取鑒定及粒徑分析 將患者血漿樣本解凍備用，依據血漿外泌體提取試劑盒要求提取血漿中的外泌體。電鏡檢測：滴加外泌體懸液至載樣銅網上，以2%磷鎢酸染液負染外泌體，電鏡下觀察外泌體形態。粒徑分析（nanoparticle tracking analysis, NTA）：以PBS緩沖液稀釋外泌體，檢測外泌體粒徑和濃度，利用ZetaView 8.04.02軟件分析并記錄數據。Western blot鑒定：利用Jurkat細胞系作為對照，鑒定外泌體中標志性蛋白CD63、TSG101和陰性標志性蛋白GM130的表達。

表1 研究對象臨床資料Table 1 Clinical data of study subjects

1.2.2 細胞體外培養 獲取健康人外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC），用含10%無外泌體血清的1640培養基重懸PBMC至合適濃度，在24孔細胞培養板中每孔添加100萬細胞，各孔加入不同組患者的血漿外泌體，置于5% CO2的37 ℃恒溫培養箱，2 h后加入CD3單抗（1 μg/ml）、CD28 單抗（1 μg/ml）和 IL-2細胞因子（200 IU/ml），培養48 h后檢測細胞活化和胞內因子水平。

1.2.3 細胞增殖效率檢測 獲取健康人PBMC，調整細胞濃度，用羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（carboxy fl uorescein diacetate succinimidyl ester, CFSE）標記，無外泌體血清洗去多余染料后用培養基重懸細胞，取少量細胞用流式細胞儀檢測標記效率，其余細胞分組與外泌體共培養，60 h后檢測細胞增殖效率。

1.2.4 流式細胞染色 表型染色：收集培養后的細胞，PBS洗滌后，加入CD4、CD8及CD38、HLA-DR抗體，避光孵育20 min，PBS洗滌后用1%多聚甲醛固定，24 h內流式細胞儀檢測。胞內因子染色：CD4、CD8表型染色后加入細胞破膜劑，混勻，4 ℃靜置40 min。破膜洗液洗滌后重懸細胞，加入IFN-γ、IL-2抗體，避光孵育20 min。破膜洗液洗滌細胞后用1%多聚甲醛固定，24 h內流式細胞儀檢測。使用FlowJo_V10軟件對所有流式數據進行分析。

1.3 統計學處理 應用SPSS 19.0軟件對所得數據進行統計學分析，用GraphPad Prism 5.0繪制統計學圖形。定量資料符合正態分布用±s表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis 檢驗，相關性分析采用Pearson相關分析。P＜0.05表明差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 CR患者血漿外泌體的特性分析 在透射電子顯微鏡下能觀察到呈球狀或杯狀的血漿外泌體，可見明顯的封閉膜結構，大小不一，直徑約100 nm（圖1A）。采用NTA檢測血漿外泌體的粒徑分布，結果顯示其顆粒分布較為集中，峰值約為85 nm（圖1B）。Western blot實驗顯示血漿外泌體表達CD63和TSG101，而不表達GM130（圖1C）。

圖1 血漿外泌體的鑒定Figure 1 Identification of plasma exosomes

2.2 各組血漿中外泌體的粒徑分布與濃度 利用NTA技術檢測了3組受試者（每組各5例）血漿中的外泌體濃度，發現3組間外泌體濃度有差異，異常組患者血漿中外泌體濃度顯著高于復常組（U=0，P=0.008）和HC組（U=2.000，P=0.032）（表2）。CR患者血漿外泌體的濃度與CD4/CD8比值呈負相關（r=-0.648，P=0.043）（圖2）。

表2 各組外泌體濃度比較（×1011顆粒數/ml）Table 2 Comparison of exosome concentration in different groups(×1011 particles/ml)

2.3 CR患者血漿外泌體對CD8+T細胞的影響

圖2 血漿外泌體濃度與CR患者CD4/CD8比值的相關性Figure 2 Correlation between the concentration of plasma exosomes and the CD4/CD8 ratio in CR patients

2.3.1 CR患者血漿外泌體對CD8+T細胞活化的影響 將不同組受試者外泌體（異常組10例，復常組9例，HC組5例）與健康人PBMC共培養，檢測外泌體對CD8+T細胞上的CD38和HLA-DR分子的共表達的影響。結果表明3組外泌體對CD8+T細胞活化水平的影響有顯著差異，異常組CD8+T細胞表面CD38+HLA-DR+的共表達水平明顯低于復常組（U=13.500，P=0.008）和HC組（U=1.000，P=0.001）（表3）。進一步相關性分析顯示，CD8+T細胞的活化水平與CR患者CD4/CD8比值呈正相關（r=0.478，P=0.039）（圖3）。

表3 外泌體對CD8+ T細胞活化水平的影響（%）Table 3 Effects of plasma exosomes on the activation of CD8+ T cells(%)

圖3 CD8+ T細胞活化水平與CR患者CD4/CD8比值的相關性Figure 3 Correlation between the activation of CD8+ T cells and the CD4/CD8 ratio in CR patients

2.3.2 CR患者血漿外泌體對CD8+T細胞分泌細胞因子的影響 通過對胞內細胞因子染色，檢測CD8+T細胞內的IFN-γ、IL-2。結果發現3組外泌體對CD8+T細胞分泌細胞因子水平的影響有顯著差異，異常組CD8+T細胞分泌IFN-γ的能力弱于復常組（U=17.000，P=0.022）和HC組（U=1.000，P=0.001）；此外，異常組CD8+T細胞分泌IL-2的能力也弱于復常組（U=8.500，P=0.001）和HC組（U=4.000，P=0.008）（表4）。CD8+T細 胞分泌IFN-γ和IL-2的水平與CR患者CD4/CD8比值均有顯著相關性（r=0.654，P=0.002；r=0.700，P＜0.001）（圖4）。

表4 外泌體對CD8+ T細胞分泌細胞因子的影響（%）Table 4 Effects of plasma exosomes on the secretion of cytokines from CD8+ T cells(%)

2.3.3 CR患者血漿外泌體對CD8+T細胞增殖的影響 3組受試者的外泌體對CD8+T細胞增殖水平的影響有顯著差異，異常組外泌體處理的CD8+T細胞增殖能力弱于復常組（U=0.000，P＜0.001）和HC組（U=3.000，P=0.005）（表5）。CD8+T細胞增殖能力與CR患者的CD4/CD8比值呈顯著正相關（r=0.716，P＜0.001）（圖5）。

3 討 論

CD4+T細胞計數是臨床評估艾滋病進展和疾病狀態最重要的預測指標，但是該指標不能全面評估HIV感染者體內免疫過度激活的風險。對于CR患者，CD4/CD8比值的高低與疾病發生進展、機體慢性炎癥和免疫活化密切相關[3-6]。但目前還不清楚是否存在獨立于cART之外的免疫調節效應分子以對抗機體過度的炎癥反應。

外泌體作為細胞間信號和物質交流的重要載體，其釋放受機體復雜炎癥環境的影響，同時可以影響機體的免疫微環境，對疾病進程產生重要影響[19-20]。本研究發現CD4/CD8比值異常的CR患者體內外泌體的濃度明顯高于CD4/CD8比值復常患者，且與CD4/CD8比值呈負相關。隨著CD4/CD8的復常，外泌體的濃度也明顯降低到接近HC水平。由此推測CD4/CD8異?；颊唧w內的慢性炎癥狀態可能是導致血漿中的外泌體水平升高的重要原因。

本研究發現，來源于CD4/CD8比值異常HIV感染者的血漿外泌體與CD8+T細胞體外共孵育時，CD8+T細胞的活化水平降低，CD8+T細胞分泌IFN-γ和IL-2的能力均受到了抑制，且CD8+T細胞的增殖功能明顯減弱，說明CD4/CD8比值異常的HIV感染者體內升高的外泌體水平對機體過度的免疫活化和炎癥發揮抑制效應，但是其表達水平升高的主動性和被動性值得我們思考。

此前對外泌體在HIV-1感染中作用的研究主要聚焦于未受感染細胞來源的外泌體對HIV-1感染的抑制，以及感染細胞來源的外泌體增強病毒感染的能力[10-14]。關于外泌體在接受長期有效cART患者免疫重建過程中所發揮作用未見報道。本研究結果提示，在CD4/CD8比值異常的HIV感染者體內，血漿外泌體對CD8+T細胞發揮了較強的免疫抑制效應。近期一些研究表明，對免疫穩態至關重要的調節性T細胞可以分泌具有類似功能的外泌體發揮免疫調節作用，形成免疫抑制性環境[21-22]。在HIV感染過程中，外泌體作為重要的細胞間信號傳導和功能分子，在抑制CD8+T細胞的功能方面發揮重要作用，可能是機體應對過夠反映經過長期cART的患者體內免疫平衡是否恢復良好。依據現有的結果，可以在后續研究中進行驗證和擴展，以利用血漿外泌體作為cART后相關免疫恢復的生物標志物或治療靶點，為艾滋病的功能性治愈提供新的研究思路。本研究不足之處在于入組患者例數較少，后續研究有待進一步擴大樣本量。HIV感染者血漿中存在來自各種組織細胞的許多外泌體亞群，如何區分患者樣品中不同細胞來源的外泌體是最主要的挑戰，后期的研究將探討各種未解決的問題。度免疫活化和炎癥反應的自身負反饋效應分子。借助自身的主動或者被動性高表達，實現抑制CD8+T細胞過度活化增殖的目的，但其具體效應機制仍須深入研究。

圖4 CD8+ T細胞分泌因子水平與CR患者CD4/CD8比值的相關性A. CD8+ T細胞分泌IFN-γ水平與患者CD4/CD8比值之間的相關性分析； B. CD8+ T細胞分泌IL-2水平與患者CD4/CD8比值之間的相關性分析Figure 4 Correlation between the secretion of cytokines from CD8+ T cells and the CD4/CD8 ratio in CR patients

表5 外泌體對CD8+ T細胞增殖的影響（%）Table 5 Effects of plasma exosomes on the proliferation CD8+ T cells(%)

圖5 CD8+ T細胞增殖能力與CR患者CD4/CD8比值的相關性Figure 5 Correlation between the proliferation of CD8+ T cells and the CD4/CD8 ratio in CR patients

本研究闡明了CR患者血漿外泌體的濃度與CD4/CD8比值的相關性，通過體外實驗證實了外泌體對CD8+T細胞功能的影響。血漿外泌體的特性，包括濃度、對正常免疫細胞功能的影響，能