清達顆粒對AngII誘導的高血壓小鼠腎臟損害的干預研究※

● 楊美玲 周雪玲 彭美中 盧 妍 彭 軍,3,4 陳友琴 Thomas Joseph SFERRA,5 褚劍鋒,3,4▲

高血壓是引起腎臟損害和終末期腎病的重要危險因素，其中過度激活的腎素血管緊張素系統是引起高血壓及高血壓腎臟損傷的重要發病機制之一[1]。現有的藥物治療措施還不能完全逆轉高血壓腎損害至終末期腎衰的進程，大量的基礎與臨床研究證實，中醫藥對高血壓腎損害的治療表現出了一定的潛力，但其相應作用機制尚不清楚。清達顆粒是陳可冀院士由其幾十年的臨床經驗方清眩降壓湯化裁而來的，主要藥物組成有天麻、鉤藤、黃芩、蓮子心，具有清肝熱、平肝陽等功效，主治高血壓病。本文采用血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)誘發的高血壓小鼠為研究對象，觀察在高血壓腎損害進程中清達顆粒對血壓、腎臟病理形態的影響，探討該方對高血壓腎臟的保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物8周齡雄性C57BL/6小鼠18只，SPF級，體重20～25g，由上海斯萊克實驗動物公司提供(實驗動物許可證號：2018093)，在福建中醫藥大學實驗動物中心飼養。

1.2主要實驗試劑與儀器AngⅡ(Sigma，RN474-91-3，A9525-10mg)；植入式膠囊滲透壓泵(ALZET)；小鼠無創血壓測量系統(肯特動物無創血壓測量系統，kent)；糖原PAS染色液試劑盒(Abcam)；Masson三色染色試劑盒(Abcam)；清達顆粒(由天江藥業有限公司制備，批號1805351)；HE染色液(索萊寶，G1120)。

1.3動物模型構建雄性C57BL/6小鼠18只適應環境一周后常規飼養，用5%水合氯醛(7ml/kg)麻醉，依據體重編號，并由此采用數字表法，隨機分為3組：(1)對照組(n=6)：剔除肩胛背部的鼠毛，作一假切口并縫合，作為對照；(2)模型組(n=6)：植入灌有AngⅡ膠囊滲透壓泵，該泵可連續28d釋放AngⅡ到周圍組織(500ng/kg/min)，最后將其縫合。(3)給藥組(n=6)：植入AngⅡ滲透壓泵并灌胃給藥治療28d。給藥組于手術后第一天開始予清達顆粒(生理鹽水溶解，制作母液備用)灌胃給藥，根據人一日一劑換算，鼠每次劑量為22.9mg/天/0.2mL，模型組和對照組灌以同等體積的生理鹽水，每天1次，連續給藥28d。

1.4血壓測量分別測量手術前、手術第1、3、5、7、14、21天及手術第28天的收縮壓和舒張壓。

1.5腎臟病理檢測新鮮小鼠腎臟組織去除包膜后，沿橫截面將腎臟切開，取1/2腎臟組織經4%多聚甲醛固定24H后，包埋、制作石蠟切片。采用HE、PAS、Masson染色觀察腎臟損傷、膠原沉積及炎癥細胞在腎臟的浸潤情況。HE、PAS和Masson法的染色程序參照試劑盒說明書。

1.6腎小球硬化程度評分[2]每張切片觀察取6個視野，評分腎小球損傷程度。分為0分：正常腎小球、無硬化；1分：輕度損傷，腎小球損傷比例<25%；2分：中度損傷，腎小球損傷比例25%～75%；4分：完全損傷，腎小球損傷比例>75%。纖維化測量方法：每張切片取6個視野，采用IPP軟件計算藍色纖維化面積占總面積的百分比。

1.7統計學方法采用SPSS18.0軟件對數據進行統計分析，計量資料若符合正態分布，以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，若不符合則以中位數和四分位數間距(M，Q)表示，采用非參數分析(秩和檢驗等)。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1清達顆粒對血壓的影響給藥前，三組的血壓差異無統計學意義(P>0.05)；給藥后，模型組的血壓從第1天開始就逐漸升高，與對照組相比具有統計學差異；給藥組的血壓(收縮壓從第7天開始到第28天、舒張壓從第21天到第28天)與模型組相比具有統計學差異(P<0.05)，清達顆粒干預顯著抑制了血壓的升高幅度。見表1、表2。

表1 清達顆粒連續給藥后各組小鼠不同時間點收縮壓變化

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

表2 清達顆粒連續給藥后各組小鼠不同時間點舒張壓變化

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

2.2清達顆粒對小鼠腎臟病理特征和硬化積分的影響如圖1所示，對照組可見腎小球形態正常無固縮，腎小囊未增大，腎小囊壁未見增厚，近、遠曲小管結構正常，未見蛋白管型；模型組可見大多數腎小球嚴重固縮，灌注不足，腎小囊增大，球囊粘連，腎小囊壁增厚(→所示)；而清達顆粒組腎小球結構形態相比模型組大有改善，腎小球固縮減輕，腎小囊減小。進一步評估腎小球硬化程度，采用積分評估，如圖2所示，與對照組對比，模型組腎小球硬化積分顯著增高(P<0.05)，清達顆粒給藥后腎小球硬化積分較模型組顯著降低(P<0.05)。PAS染色顯示(圖3)，模型組腎小球固縮，基底膜增厚、腎小管萎縮、腎小囊增寬(→所示)，清達顆粒干預顯著改善上述病理特征。

圖1 清達顆粒對AngⅡ引起的腎臟損害的一般病理影響(HE染色，×400)

圖2 清達顆粒對各組腎小球硬化程度積分的影響

圖3 清達顆粒對AngⅡ引起的腎小球基底膜的影響(PAS染色，×400)

2.3清達顆粒對腎臟纖維化的影響如圖4所示，與對照組對比模型組腎小球和腎間質藍染明顯(→所示)，清達顆粒干預后，藍染的膠原纖維明顯減少。如圖5所示，與對照組比較，模型組腎小囊及腎間質膠原陽性表達明顯(P<0.05)，給藥組腎小囊及腎間質纖維性物質較模型組明顯減少，差異具有統計學意義(P<0.05)。

圖4 清達顆粒對AngⅡ引起的腎臟纖維化的影響(Masson染色，×400)

圖5 清達顆粒對各組腎臟膠原陽性區域比率的影響

3 討論

高血壓是最常見的慢性疾病之一，在《中國高血壓防治指南2018修訂版》中，將高血壓的診斷標準定為：在未使用降壓藥物的情況下，診室收縮壓≥140mm Hg和(或)舒張壓≥90mm Hg；根據血壓水平分為正常、正常高值血壓和1、2、3級高血壓；同時，還根據血壓水平、心血管危險因素、靶器官損害、臨床并發癥和糖尿病進行心血管危險分層，分為低危、中危、高危和很高危4個層次。3級高血壓伴1項及1項以上危險因素，合并靶器官損害、CKD3期以上、糖尿病等均屬于心血管風險很高危患者[3]。可見，高血壓具有高發病率及致死率，可累及多處靶器官。其中，腎臟損傷是高血壓很常見的并發癥之一。美國最新腎臟疾病統計數據顯示，高血壓是導致終末期腎病的第2位病因[4-5]。

AngⅡ是血管緊張素中最重要的組成部分，具有收縮血管、促進醛固酮分泌、參與渴覺反應、影響心輸出量、增加血管通透性等生理功能。其中收縮血管和促進醛固酮分泌是最為重要的[6]。研究證明，Ang Ⅱ通過作用于球狀帶上的AI受體(受體存在于細胞膜上)，二者結合以后誘導生成一種酶蛋白，后者便以某種方式促使膽固醇轉變成孕烯醇酮，然后孕烯醇酮再經多次轉變，最后生成醛固酮。當醛固酮分泌過多時將引起鈉水潴留進而血壓升高[7]。因此，AngⅡ不僅能影響小動脈的緊張度，而且還能影響血容量，這兩種因素的相互作用，在很大程度上，決定了血壓的高低。腎臟器官的細胞上存在有血管緊張素受體，有研究表明，高血壓腎損害的發病機制與交感神經系統(SNS)活性升高、腎素-血管緊張素系統異常、鹽負荷、遺傳或先天因素、高血壓狀態下腎小球前小動脈阻力增加及腎小球內高壓有關[4]。

清達顆粒是陳可冀院士由其60余年臨床經驗方清眩降壓湯[8]化裁而來，主要用于治療高血壓病患者。其中天麻、鉤藤平肝潛陽熄風，輔以蓮子心、黃芩清熱滋陰，共奏平肝陽、清肝熱之功。本研究發現該方可以降低AngⅡ誘導的高血壓小鼠的收縮壓、舒張壓。與模型組對比，該方較好地抑制了由高血壓導致的腎小球硬化固縮、腎小管增生、蛋白管型形成，改善腎臟纖維化等。其機制可能與抑制循環腎素-血管緊張素-醛固酮系統活性，控制血壓的升高有關。

中藥組方的整體調節特征與辨證觀念是從多靶點、多層次的整體較為綜合的層面發揮藥理學作用，從而達到防病治病的目的。清達顆粒可能是通過有效中藥成分調控RAAS的平衡，以此發揮降壓作用，改善臨床癥狀，促進腎損害等病理改變的恢復，不僅起到了降低血壓的作用，還從整體上保護靶器官的損害。綜上所述，清達顆粒能夠抑制AngⅡ誘導的血壓升高幅度，減輕由于高血壓導致的腎損害。本次研究沒有對藥物劑量梯度進行評價，是否增加劑量能夠進一步提高療效，相關藥效機制是什么，與交感神經系統活化、整個RAAS有關與否，是否與血管內皮功能保護有關等等，一系列的問題都值得進一步研究與探索。今后相關研究工作也將沿著上述問題，以及規范的臨床療效評價來開展，也期望能夠獲得令人滿意的結果。