高效液相色譜法評(píng)價(jià)海洋生物中半胱亞磺酸脫羧酶活性

張千偉 徐紅萍 毛麗沙 金火喜

摘要[目的]建立磺基丙氨酸（CA）的高效液相色譜分析法，并以CA為底物，評(píng)價(jià)不同海洋生物組織中半胱亞磺酸脫羧酶（CSD）的活性。[方法]以AgilentEclipseXDB-C18為色譜柱，采用鄰苯二甲醛（OPA）進(jìn)行柱前衍生，檢測(cè)波長(zhǎng)為315nm，對(duì)衍生化過程及色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。[結(jié)果]當(dāng)CA∶OPA（物質(zhì)的摩爾比）=1∶2、衍生時(shí)間2min、流動(dòng)相甲醇∶乙酸鈉=65∶35（V/V）、流速1mL/min時(shí)，CA具有最優(yōu)的檢測(cè)效果。在該條件下，CA濃度在10～500μg/mL具有良好的線性關(guān)系（R2>0.99），平行樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～8.6%，保留時(shí)間為1.4～1.5min。不同海洋生物組織中CSD活性檢測(cè)結(jié)果顯示，在所選擇的海洋貝類、頭足類、魚類中，貽貝、疣荔枝螺和大黃魚均未檢測(cè)到CSD活性;蟶子、血蛤、芝麻螺和魷魚中CSD活性較低。不同組織比較，海鱸魚肝臟中CSD活性最高，達(dá)21.8U/mg，而肉和鰓中則未檢測(cè)到CSD活性。[結(jié)論]不同海洋生物體內(nèi)?；撬岬暮铣赏緩讲槐M相同。

關(guān)鍵詞海洋生物;半胱亞磺酸脫羧酶;磺基丙氨酸;高效液相色譜

中圖分類號(hào)TS201.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2019）01-0212-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.062

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

?；撬幔址Qβ-氨基乙磺酸，是動(dòng)物體內(nèi)含硫氨基酸代謝的最終產(chǎn)物之一。?；撬釓V泛分布于哺乳動(dòng)物和海洋生物中，像哺乳動(dòng)物的腦、肝臟及貝類、螺類等海洋生物中?；撬岬暮烤重S富[1-5]。牛磺酸被認(rèn)為具有廣泛的生理學(xué)功能，如保護(hù)細(xì)胞膜、解毒以及抗氧化等[6-7]。研究證明，?；撬徇€具有促進(jìn)大腦發(fā)育、增強(qiáng)人體免疫和改善視力等功效[8-10]。

?；撬岬纳锖铣赏緩捷^為復(fù)雜[11]，不同的生物體內(nèi)其合成途徑存在一定差異。研究發(fā)現(xiàn)，通過半胱氨酸雙加氧酶（CDO）催化半胱氨酸形成半胱亞磺酸（CSA），再經(jīng)半胱亞磺酸脫羧酶（CSD）催化脫羧生成亞?；撬?，最后氧化成?；撬崾巧矬w內(nèi)合成牛磺酸最主要的途徑[12]。除此之外，某些生物還可以通過CSA—磺基丙氨酸（CA）—?；撬嵬緩交虬腚装贰獊喤；撬帷；撬嵬緩降扰月吠緩絹砗铣膳；撬帷＠?，藍(lán)鰓太陽(yáng)魚（Lepomismacrochirus）中具有較高的半胱胺雙加氧酶（CAD）活性[11]，可以通過CA脫羧形成?；撬醄13]。在上述途徑中，CSA和CA的脫羧反應(yīng)均由同一個(gè)酶CSD催化。目前，有關(guān)?；撬嵘锖铣赏緩降难芯恐饕性谥饕緩缴?，對(duì)CA脫羧生成?；撬嵬緩降难芯旷r有文獻(xiàn)報(bào)道。據(jù)此，該研究以CA為底物，對(duì)不同海洋生物組織中CSD的活性進(jìn)行檢測(cè)和篩選，彌補(bǔ)國(guó)內(nèi)該研究領(lǐng)域的空白，為進(jìn)一步明確不同海洋生物體內(nèi)牛磺酸的合成途徑提供參考。

從海洋生物組織樣品中提取CSD粗蛋白，加入底物CA，在緩沖體系中進(jìn)行反應(yīng)，通過分析反應(yīng)前后CA含量的變化可評(píng)價(jià)樣品中CSD的活性。氨基酸通過異硫氰酸苯酯、單磺酰氯、鄰苯二甲醛（OPA）等衍生化后可在高效液相色譜上進(jìn)行檢測(cè)[14-16]，其中OPA衍生法因安全、簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。該試驗(yàn)采用OPA為衍生劑，甲醇-乙酸鈉為流動(dòng)相，擬建立峰形良好、快速靈敏的CA檢測(cè)方法，利用該方法評(píng)價(jià)不同海洋生物中CSD的活性。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1試材。

貽貝、血蛤、芝麻螺、疣荔枝螺、海鱸魚等海洋生物購(gòu)于舟山市樂購(gòu)超市。

1.1.2藥品與試劑。

磺基丙氨酸（CA）、?；撬?、鄰苯二甲醛（OPA）、牛血清蛋白、甲醇、乙酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸銨、硼酸、氫氧化鈉、巰基乙醇和考馬斯亮藍(lán)G-250等藥品和試劑均購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.3儀器與設(shè)備。

1200高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）;FS-1高速勻漿機(jī)（江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠）;SHZ-88A水浴恒溫振蕩器（蘇州市培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1溶液的配制。

衍生試劑：準(zhǔn)確稱取0.01gOPA于1mL甲醇中，超聲波輔助下溶解，再加入10μL巰基乙醇，用0.4mol/L的硼酸鈉緩沖液（pH9.5）定容至10mL即可，現(xiàn)配現(xiàn)用。CA標(biāo)液（1mg/mL）：準(zhǔn)確稱取0.05gCA固體，溶解于50mL0.2mol/L磷酸鹽緩沖液中（pH7.4）。牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（0.1mg/mL）：準(zhǔn)確稱取0.01g牛血清蛋白溶解于100mL0.2mol/L磷酸鹽緩沖液中?？捡R斯亮藍(lán)試劑：準(zhǔn)確稱50mg考馬斯G-250，將其溶于50mL95%乙醇中，再加入50mL85%磷酸，定容至500mL。

1.2.2CA高效液相檢測(cè)。

取CA溶液250μL至離心管中，加入一定量的衍生劑，在37℃水浴下進(jìn)行衍生化反應(yīng)。反應(yīng)液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，立刻進(jìn)行HPLC分析。色譜條件：色譜柱AgilentXDB-C18（4.6mm×150mm，5μm），流動(dòng)相甲醇-乙酸鈉溶液，波長(zhǎng)315nm。根據(jù)峰形、峰面積、保留時(shí)間等指標(biāo)對(duì)流動(dòng)相比例、流速、衍生劑用量、衍生化時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.3CA標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。

將CA標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/mL）用超純水依次稀釋成0.50、0.40、0.20、0.10、0.05、0.02、0.01mg/mL7個(gè)質(zhì)量濃度梯度。按照“1.2.2”步驟，在最優(yōu)條件下對(duì)CA濃度進(jìn)行測(cè)定。以CA質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4精密度試驗(yàn)。

分別取0.01、0.10和0.50mg/mL的CA標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.2.2”步驟，在最優(yōu)條件下對(duì)CA濃度進(jìn)行測(cè)定。每種質(zhì)量濃度平行測(cè)定3次，記錄峰面積，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.5樣品中CSD活性檢測(cè)。

將新鮮的海洋生物洗凈，取肉、內(nèi)臟、鰓等組織部分。分別稱取20g，加入50mL磷酸鹽緩沖液，在循環(huán)水控溫下，勻漿30min。將勻漿液置于8000r/min下離心20min，去沉淀。上清液在4℃下用70%硫酸銨鹽析4h，10000r/min離心15min，棄上清液。沉淀中加入50mL磷酸鹽緩沖液，并置于同種緩沖液中透析12h，中途更換一次緩沖液。試驗(yàn)組取透析后的粗酶液1mL，加入0.05mol/L的CA溶液1mL，再加入0.2μmol磷酸吡哆醛和4.0μmol巰基乙醇。另取0.05mol/L的CA溶液1mL，加入1mL磷酸鹽緩沖液、0.2μmol磷酸吡哆醛和4.0μmol巰基乙醇，作為空白組。將試驗(yàn)組和空白組均于37℃、120r/min條件下反應(yīng)2h，反應(yīng)液按照“1.2.2”方法檢測(cè)CA的含量。在上述反應(yīng)條件下，每分鐘催化反應(yīng)掉1nmolCA所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位（U）。

1.2.6粗酶液的蛋白濃度測(cè)定。

采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定粗酶液中蛋白質(zhì)濃度。配制一系列濃度梯度的牛血清標(biāo)準(zhǔn)蛋白液，各取1mL標(biāo)準(zhǔn)液，加5mL考馬斯亮藍(lán)試劑，搖勻后在595nm測(cè)吸光度。以牛血清蛋白濃度為橫坐標(biāo)、A595nm為縱坐標(biāo)，繪制牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。取1mL樣品粗酶液，加5mL考馬斯亮藍(lán)，搖勻后測(cè)A595nm，依照牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品蛋白濃度。

2結(jié)果與分析

2.1流動(dòng)相比例選擇

選用甲醇與0.05mol/L的乙酸鈉作為流動(dòng)相，分別選擇體積比20∶80、30∶70、40∶60、50∶50和65∶35進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。由表1可知，在所選的所有體積比下，CA均能達(dá)到很好的分離效果，但保留時(shí)間隨著甲醇比例的增加而縮短。綜合考慮峰面積（較大為宜）及保留時(shí)間（較短為宜），確定流動(dòng)相甲醇-乙酸鈉的比例為65∶35。

2.2流動(dòng)相流速優(yōu)化

流動(dòng)相的流速是高效液相色譜檢測(cè)法的一個(gè)重要因素，流速過慢，峰形變寬，保留時(shí)間延長(zhǎng)，效率降低;流速過快則峰面積太小，導(dǎo)致靈敏度降低。該試驗(yàn)選擇甲醇-乙酸鈉（65∶35，V/V）為流動(dòng)相，考察了不同流速（0.6、0.8、1.0、1.2、1.5mL/min）對(duì)CA（1mg/mL）檢測(cè)的影響。從表2可以看出，流速對(duì)CA的出峰時(shí)間及峰面積均有顯著影響，隨著流動(dòng)相流速的不斷增大，保留時(shí)間逐漸縮短，峰面積則不斷下降。綜合考慮峰面積和保留時(shí)間，選擇1.0mL/min為最終流動(dòng)相的流速。

2.3衍生劑用量選擇

該研究采用OPA對(duì)CA進(jìn)行衍生化，OPA的用量對(duì)衍生化產(chǎn)物的濃度有直接影響。OPA用量不足，衍生化反應(yīng)不完全，目標(biāo)物質(zhì)峰面積減小;OPA用量過多，則會(huì)導(dǎo)致藥品的浪費(fèi)。該試驗(yàn)考察了OPA的不同用量（CA與OPA的摩爾比分別為2∶1、1∶1、1∶2、1∶3和1∶5）對(duì)CA檢測(cè)的影響，結(jié)果如表3所示。由表3可知，隨著OPA用量的增加，CA峰面積也逐漸增加;當(dāng)OPA與CA的摩爾比超過2∶1時(shí)，峰面積趨于穩(wěn)定，說明OPA已經(jīng)過量。所以，最終選擇OPA與底物CA的摩爾比為1∶2。

2.4衍生化時(shí)間優(yōu)化

該試驗(yàn)考察了底物CA與衍生試劑OPA反應(yīng)的時(shí)間對(duì)峰面積的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，峰面積從0.5min時(shí)的7335迅速增加至2min時(shí)的11109，說明CA與OPA反應(yīng)迅速。然而，隨著反應(yīng)時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，峰面積有緩慢下降的趨勢(shì)，說明衍生化產(chǎn)物不是十分穩(wěn)定，會(huì)慢慢分解。所以，該試驗(yàn)采用衍生時(shí)間為2min。

2.5CA色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)曲線

在上述最優(yōu)條件下，CA標(biāo)樣（1mg/mL）的色譜圖如圖2，可見其峰型美觀，且沒有雜峰干擾。以CA質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制CA標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示。當(dāng)CA在10～500μg/mL時(shí)，CA質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=12134x+9.519（R2=0.991）。

2.6精密度試驗(yàn)

選擇3個(gè)不同質(zhì)量濃度的CA標(biāo)樣，分別為低質(zhì)量濃度（10μg/mL）、中質(zhì)量濃度（100μg/mL）和高質(zhì)量濃度（500μg/mL），同一樣品重復(fù)測(cè)定3次，峰面積見表4。這3種質(zhì)量濃度的CA標(biāo)樣相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為8.6%、0.9%和4.9%，說明該方法精密度較高，具有良好的重復(fù)性。

2.7海洋生物樣品中CSD活性的評(píng)價(jià)

該試驗(yàn)選擇了舟山海域常見的幾種海洋生物，將其組織經(jīng)洗凈、勻漿、鹽析和透析后得粗酶液。粗酶液中蛋白含量按“1.2.6”中方法進(jìn)行測(cè)定，其牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示。由圖4可知，牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線有良好的線性關(guān)系。分別向各組織樣品初酶液中加入底物CA，37℃、120r/min條件下維持2h，檢測(cè)反應(yīng)前后CA含量的變化，從而評(píng)價(jià)樣品中CSD的活性。

從表5可以看出，在所選擇的海洋生物中，貽貝、疣荔枝螺和大黃魚體內(nèi)未檢測(cè)到CSD活性，而蟶子、血蛤、芝麻螺和魷魚體內(nèi)均檢測(cè)到CSD活性。該結(jié)果說明，貽貝、疣荔枝螺和大黃魚不具有通過CA合成?；撬岬哪芰Γ|子、血蛤、芝麻螺和魷魚則可以通過這個(gè)途徑合成?；撬?。針對(duì)海鱸魚和美國(guó)紅魚不同組織的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同組織中CSD活性也有明顯差異。海鱸魚腸和肝中CSD活性的活性分別達(dá)6.0和21.8U/mg，而肉和鰓中則未檢測(cè)到CSD活性;美國(guó)紅魚腸中檢測(cè)到很低的CSD活性，其他組織中則未檢測(cè)到CSD活性。柳小英等[17]報(bào)道這些組織中均含有一定量的?；撬幔Y(jié)合該試驗(yàn)結(jié)果，說明同一種生物的不同組織可以通過不同的途徑來合成?；撬帷?/p>

海洋生物尤其是海洋貝類、螺類、魚類等，其體內(nèi)?；撬岬暮渴重S富，是獲取天然?；撬岬膶殠?kù)。?；撬嵩诓煌M織中的含量差異較大，一般來說，肝臟中?；撬岷枯^高。CSD是很多生物體內(nèi)?；撬岷铣傻年P(guān)鍵限速酶，其活性的大小往往決定了?；撬岷康母叩?。CSD可以介導(dǎo)?；撬岷铣傻?條途徑，但不同生物組織內(nèi)的CSD對(duì)CSA和CA的活性有所差異。研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)鰓太陽(yáng)魚肝臟內(nèi)CSD對(duì)CSA的活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于CA，真鯛肝臟內(nèi)CSD則對(duì)CA的活性大于CSA，而來自虹鱒魚肝臟的CSD對(duì)CA基本沒有活性[12-13]。所以，該研究以CA為底物，檢測(cè)海洋生物體內(nèi)CSD的活性，可一定程度上分析不同海洋生物體內(nèi)?；撬岬暮铣赏緩?，為揭示?；撬岬暮铣蓹C(jī)制提供一定的參考基礎(chǔ)。

3結(jié)論

該試驗(yàn)建立了磺基丙氨酸的高效液相色譜分析方法。采用OPA進(jìn)行衍生，檢測(cè)波長(zhǎng)315nm，流動(dòng)相甲醇∶乙酸鈉=65∶35（V/V），流速為1mL/min，CA∶OPA=1∶2，衍生時(shí)間

2min。該方法在10～500μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好

的線性關(guān)系（R2>0.99），相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～8.6%。以CA為底物，利用該方法評(píng)價(jià)不同海洋生物中CSD的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同的海洋生物中CSD活性差異較大，其中海鱸魚肝臟中活性最高，而大黃魚、貽貝和疣荔枝螺中未檢測(cè)到CSD活性。該研究表明不同海洋生物體內(nèi)?；撬岬暮铣赏緩接兴町?。

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