水通道蛋白5在干燥綜合征中的作用綜述*

沙明慧，吳素玲**南京中醫藥大學，南京 009；南京市第一醫院，南京 000

水通道蛋白5（AQP5）是一種膜轉運蛋白，最先是從大鼠頜下腺的cDNA中擴增出來的[1]，1996年被Lee等成功克隆，近年來關于其相關信號通路研究備受關注。干燥綜合征（SS）是一種以侵犯外分泌腺為主的慢性炎癥性自身免疫性疾病，臨床多以口眼干澀為主要表現，可累及肺脾肝腎、甲狀腺等多臟器，好發于40～50歲女性，男女比例為1∶9。目前病因及發病機制并不十分明確，現代醫學尚無理想的治療方案，主要是對癥緩解干燥癥狀，阻止、延緩病情進展，治愈率較低，可嚴重影響患者健康水平及生活質量。SS是現代醫學的一大疑難病問題，調控AQP5有可能是改善SS癥狀的關鍵點。

1 AQP5的生物學特征

1.1 AQP5的結構

水通道蛋白家族（aquaporins，AQPs，結構見圖 1）是動植物細胞膜上的水孔蛋白簇，目前已發現有13種水通道蛋白（AQP 0-AQP 12），是一種整體膜蛋白。其中AQP5由六螺旋多肽鏈組成，可6次跨膜，分子量約28 kD，包含有5個襻，細胞外為親水性A、C、E環，細胞內為疏水性B、D環。其中A、C、E環的氨基端和羧基端位于細胞內，兩者重復部分構成AQP，分子前后蛋白基序相似，形成了以整個AQP分子為中心的對稱鏡像結構。而B環和E環均具有NPA基本序列（Asp-Pro-AIa，天冬酰氨酸-脯氨酸-丙氨酸基序），B、E 環在NPA處向細胞膜內凸起、褶皺形成一個單孔凹穴，使AQP5呈“沙漏樣”結構、鉤嵌在細胞膜上，4個單體形成四聚體以凹穴為中心排列，構成了腺體的特異性分泌通道，有高滲性特征，在水轉運功能上起到了決定性作用。凹穴內側的A-73和C-189殘基若缺失或被替代，均可導致水液轉運障礙。此外，AQP5是汞劑敏感性通道，182位的半胱氨酸可與汞劑結合、抑制水通道功能。AQPs中幾乎所有亞型及同源蛋白中都具有NPA這個典型氨基酸序列。人的AQP5氨基酸序列與大鼠、小鼠的同源性分別為98%、90%，與大鼠基本無差異性[2]。

圖1 AQP5的晶體結構[3]

1.2 AQP5的分布

AQPs因表達組織及具體部位的不同，有組織和細胞特異性，各自發揮不同的生理特征。其中AQP5主要分布于淚腺、涎腺以及角膜、上呼吸道、肺泡Ⅰ型細胞等各類分泌性上皮細胞及腺體處。在某些組織器官中AQP5也有高表達，如肺、腎；在腦、胰腺、小腸等器官及組織中未見表達。此外，在正常情況下，AQP5存在于細胞囊泡中，受到體內外某些刺激后出現由囊泡向細胞頂膜 “轉位”并發生融合的現象，即AQP5的重新分布特性。李磊磊等[4]表明，AQP5可能參與了肺脹陽虛水泛證水液代謝失衡的過程。任鴻昌[5]實驗結果表明，胰蛋白酶導致的急性肺損傷后期，AQP5在肺組織中表達逐漸下降，促進了肺水腫形成，肺損傷程度相應加重。秦崧[6]發現，AQP5高表達于肺、呼吸道黏膜下腺腺體細胞腔，為適應極干旱荒漠環境提供了蛋白水平依據。在氣道高反應過程中，AQP5的表達下調，粘蛋白MUC5B高表達，氣道粘液高分泌。Ma T等[7]發現，AQP5基因敲除小鼠較野生型小鼠肺內滲透壓依賴的水轉運下降90%。總之，AQP5的異常分布、轉運對水液代謝、維持滲透壓平衡和腺體分泌等有重大影響。

2 AQP5的生物學功能

2.1 AQP5及其相關信號通路

2.1.1 TLR4/MyD88/NF-κB/AQP5信號通路 Toll樣受體4（Toll like receptor，TLR4）可通過與核因子 NF-κB（nuclear factor of kappa B）相應配體結合，激活NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶信號通路，來促進各類炎癥因子的釋放。NF-κB的激活可以使 AQP5低表達[8，9]。而髓樣分化因子 88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）是TLR信號轉導途徑中主要的接頭蛋白，故可調節TLR4/NF-κB信號通路。

2.1.2 MBD2/AQP5信號通路 去甲基化酶MBD2（methyl-CpG binding domain2）是一種特異性結構域蛋白，甲基化的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤（CpG）是MBD2的啟動子，MBD2與其結合受到啟動后，具有去甲基化功能，可使DNA甲基化，從而參與AQP5基因表達受抑，具體作用及調控機理尚不清楚。故MBD2/AQP5信號通路可能是AQP5表達的重要調控機制之一。

2.1.3TNF-α/TNFR/IKK/NF-κB、MKK/p38/c-Fos、TRAF6/JNK/c-Jun信號通路 腫瘤壞死因子TNF-α通過與其受體1（TNFR1） 相結合形成的復合物可激活 NF-κB；IκB 激酶（IKK）的激活可使 IκB磷酸化、降解，促使 NF-κB激活，從而抑制AQP5蛋白和mRNA的表達。p38、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）與 c-junN-末端激酶（JNK）并稱為應激活化的蛋白激酶（SAPKs）。NF-κB 是細胞外調節蛋白激酶 （extracellular regulated protein kinases，ERK）/MAPK信號通路的下游調節因子。JNK屬于MAPK家族的一種信號轉導蛋白，受其上游激酶激活后，可傳導ERK、JNK、p38等通路，調控細胞遷移。p38蛋白與JNK相似，同屬MAPK家族亞類，p38-MAPK被上游激活后可磷酸化IκB，并將之降解，IκB、NF-κB 解聚，NF-κB 被激活，產生促炎效應，可調節細胞增殖、分化。NF-κB、JNK都是由TNF-α信號通路介導的。高表達的ERK、p38和JNK均抑制AQP5表達[10]。

以上各種信號通路均可調控AQP5，使AQP5轉錄抑制，故在功能上有相似之處，但屬于不同途徑來調節水液代謝和腺體分泌。目前對于影響AQP5的信號轉導通路的研究及認識尚且不足，但為AQP5與SS之間的研究提供了思路，其主要區別為基因水平與分子水平的不同研究方向。

2.2 AQP5的調節機制

AQP5是一種利用滲透壓差有效促進水分子快速轉運的跨膜轉運蛋白，在生物體內有長時調節和短時調節兩種調節機制。長時調節主要是指通過某些方法干預可促使AQP5 mRNA和蛋白水平的上升，以及提升其跨膜轉移的生物學功能，即調節AQPs含量作用。例如，Smith JK[11]將IFN-α加入人的唾液上皮細胞，經過1 h刺激，可顯著上調AQP蛋白和mRNA。短時調節則是指在內環境等因素調節下，可以改變AQP5的生物學特征和功能，即調節AQPs活性作用，目前公認磷酸化機制和穿梭機制參與了AQP5的短時調節。AQP5結構的主要作用是蛋白激酶 A（protein kinaseA，PKA）和蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）介導的磷酸化，AQP5 含有PKA和PKC磷酸化的同源序列，使AQP5結構改變，膜通透性增加，從而產生“快速閘門”效應，證實了AQP5在水液的轉運、門控等方面發揮著重要的調節作用，而AQP5的磷酸化功能是依賴cAMP實現的，可以通過調整cAMP活性來節制磷酸化作用。穿梭機制則是指通過改變內環境中Ca2+濃度、細胞結構等條件，在某些因素影響下，可使正常存在于細胞內囊泡中的AQP5轉位，從而改變細胞膜通透性及功能性水通道數目，表明AQP5具有調節水分子重新分布的生物學功能。例如，在SS相關的AQP5表達下調研究中，用乙酰膽堿刺激腺體腺泡細胞表面M3受體，并與其相結合來啟動二級信號傳導效應，促使Ca2+濃度增加，誘導胞質內的AQP5經囊泡向腺泡細胞頂膜轉運。上述現象主要通過增強電解質活躍轉運及誘導AQP5“轉位”等途徑實現的，都可以增強腺泡細胞的水分子輸出，從而共同參與AQP5的水跨膜轉運調節功能。

2.3 AQP5與其他疾病相關性

AQP5的缺失及功能失調會引起多系統疾患。在角膜疾患中，AQP5功能失調會導致角膜水腫、干眼癥。而Ⅰ型糖尿病引起的口腔干燥癥、老年性口干癥、頭面部放療后口干癥，均與SS發病機制及臨床表現相似。AQP5在類風濕關節炎（Rheumatoid arthritis，RA）小鼠中明顯表達上調，并與 CD90、CD44在小鼠骨髓間充質干細胞膜上共表達[12]，這說明AQP5與RA的發病機制也有一定關系。在呼吸系統、溫燥條件下和肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）感染后均能引起肺部AQP5低表達[13]；在慢性阻塞性肺疾病大鼠模型中，AQP5在氣道中的表達明顯減少（P<0.01）[14]。劉春枝等[15]研究發現，新生兒呼吸窘迫綜合征（respiratory distress syndrome of newborn，RDSN）患者的AQP5水平明顯上調，且與病情嚴重程度、胎齡及預后呈一定相關性。中醫藥方面發現，參七化痰方、三仁湯、竹瀝等均可通過調節AQP5表達水平，阻礙粘液高分泌，從而改善肺通氣狀態[14，16]；此外，AQP5與氣道高反應相關，故與哮喘發病等也有一定關系。AQP5在皮膚系統主要表達于皮膚顆粒層角質細胞的細胞膜，對維持皮膚細胞間水穩態發揮重要影響。目前多項研究顯示，AQP5失調與梅尼埃病、高血壓病、糖尿病腎病、變異性鼻炎等的發病機制也具有一定相關性[17-19]。也有學者認為，AQP5可能還參與了近排卵期卵巢囊內液體動態平衡。另有研究顯示，AQP5在乳腺癌、胃癌、肝癌、肺癌、宮頸癌、結直腸癌等人類多種腫瘤中過表達，由此證明AQP5的主要功能有調節腫瘤細胞的遷移、增殖和凋亡，與淋巴轉移及預后不良也具有一定相關性[20-22]。

3 AQP5在SS發病中的作用

3.1干燥綜合征概況

干燥綜合征是一種主要侵犯淚腺、唾液腺等外分泌腺體的炎癥性自身免疫性疾病，具有高度淋巴細胞浸潤，腺體細胞受損的特征。屬中醫“燥證”“燥痹”范疇。中醫認為，燥痹雖以陰虛津虧為本，然而津液輸布障礙亦是關鍵。調控AQP5正是符合中醫疏通布津通道之法，旨在促進津液輸布通達，得以濡養四肢百骸及皮膚、官竅。臨床研究已發現，SS患者淚液中AQP5的表達量較健康人群明顯升高，目前認為是慢性淋巴細胞浸潤和破壞導致淚腺腺泡細胞受損、AQP5漏入淚液中導致。同時AQP5表達量的減少，可引起唾液流量減少、粘稠度增加，導致分泌異常。結合AQP5的結構功能特性，不難得出AQP5與SS發病具有高度相關性。

西醫治療方面，干燥綜合征目前尚無根治方法。一方面主要是人工唾液、淚液的替代治療，可對癥緩解口眼干燥癥狀，或者用毒蕈堿膽堿能受體（muscarinic receptors）激動劑，刺激外分泌腺分泌；另一方面，SS患者應及時給予系統治療，包括以下幾點：①免疫抑制和免疫調節治療：羥氯喹（hydroxychloroquine,HCQ）200～400mg·d-1［6～7mg·（kg·d）-1］常作為初始治療，其他有甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）7.5～15 mg·w-1［2～3mg·（kg·w）-1］，環磷酰胺（CTX）50～150 mg·d-1或 0.5～1 g·（m2·4w）-1，來氟米特（leflunomid，LEF）10～20 mg·d-1，硫唑嘌呤（azathioprine，AZA）50～100 mg·d-1［1～2 mg·（kg·d）-1］，環孢素 A（cyclosporinA，CsA）2.5～5 mg·（kg·d）-1，嗎替麥考酚酯（mycophenolate mofetil，MMF）0.75～2 g·d-1。 ②糖皮質激素治療：根據病情決定用量，潑尼松10～60 mg·d-1，必要時甚至需要糖皮質激素沖擊治療。③生物制劑：目前有抗CD20單克隆抗體（利妥昔單抗，rituximab）、抗CD22單克隆抗體（依帕珠單抗，epratuzumab）等治療活動性SS有一定臨床療效。④其他：非甾體抗炎藥（NSAIDs），如洛索洛芬鈉片、雙氯芬酸、塞來昔布和美洛昔康等。

3.2AQP5與SS的關系

有關學說認為，AQP5的亞細胞分布及轉運異常可能是SS發病的的重要機制之一。在炎癥浸潤的NOD小鼠頜下腺腺泡中，AQP5在其頂質膜表達減少而在基底膜表達增加。Konttinen YT等[23]發現，AQP5在SS模型小鼠的涎腺上皮表達減少或消失，在肌上皮表達增強。此后在pSS患者中也驗證了上述結果。且目前已有臨床試驗[24]發現，在抗腫瘤壞死因子-α（TNF-α）抗體（infliximab）治療 pSS 前后，AQP5 的分布由腺泡細胞表面的腔面、基底側面集中轉移至腔面，并據此推測恢復AQP5在腔面的適當分布，可以增加無刺激狀態下SS患者的唾液流率。通常認為，AQP5主要是在涎腺腺泡細胞的頂質膜上定位，而目前已發現，在SS患者及小鼠模型的涎腺中，AQP5在頂質膜上分布減少，而在基底膜上增加，借此AQP5調節水分子重新分布功能發揮作用，這說明AQP5在SS的水轉運及腺體分泌過程中，至少在刺激唾液分泌中有重要生理特性。而自身IgG抗體及其介導的抑制作用、體內滲透壓、cAMP、PKA等因素都已被證實參與了AQP5以上調控過程。總之，AQP5的缺失、異常分布或轉運對SS患者的水液代謝和腺體分泌過程都有重大影響。另外，免疫斑點實驗證明，AQP5在分泌粘液的頜下腺及舌下腺的表達遠較單純分泌漿液的腮腺豐富。據此又推測，AQP5從本質上有粘液水合作用及溶解作用，而不是液體的分泌作用，但此觀點仍需進一步研究證實。

目前眾多研究已發現，AQP5及其相關信號通路在SS中可能發揮重要作用。從動物實驗中發現，在SS動物模型中NF-κB表達增加，進而激活炎癥反應，引起血清中相關炎癥因子 TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β 和 IFN-γ 等的增加，可加劇SS小鼠腺體細胞的損害[25，26]。而 NF-κB是 AQP5的上游啟動序列之一，在原發性干燥綜合征 （Primary Sjogren's syndrome，pSS）的患者中，唇腺、涎腺細胞中的 TLR4和 MyD88較正常人群呈高表達狀態。浸潤性單核細胞、腺泡細胞和導管上皮細胞中也同樣發現了TLR4和MyD88的表達。故不難得出結論：TLR4/MyD88/NF-κB/AQP5信號通路與 AQP5高度相關，并與SS的發病具有一定相關性。近年來亦有研究表明，AQP5及其相關信號通路對頜下腺炎癥具有明顯調節作用。據臨床觀察，放療后患者唾液腺損傷導致的口干癥與SS臨床表現大致相仿，而AQP5的低表達與SS發病密切相關。李瑩[27]已證實了因γ射線輻射引起的AQP5表達降低，從而致使SS的分子機制：在電離輻射致傷人頜下腺（human submandibular gland，HSG）的細胞中，MBD2可以促進AQP5的表達。AQP5的結構特征決定了一旦AQP5表達量減少、缺失及分布異常都可使水轉運失代償，腺體分泌減少，從而出現口干眼干等癥狀。故MBD2/AQP5信號通路可能在SS患者頜下腺的水分子跨膜轉運及腺體分泌過程中發揮重要作用。趙紅玉等[10]在蛋白印跡實驗中檢測到SS模型小鼠頜下腺細胞中NF-κB、p38、c-Jun三種蛋白明顯高表達，同時AQP5低表達， 而且三者分別是 TNF-α/TNFR/IKK/NF-κB、MKK/p38/c-Fos、TRAF6/JNK/c-Jun信號通路發揮作用的關鍵蛋白，故提示以上三條信號通路可能通過抑制AQP5表達參與了SS的發病機制。同時該作者證實，增液湯對這三種關鍵蛋白均有抑制作用，進一步提示增液湯可能通過調控這三條信號轉導通路，上調AQP5的表達，從而抑制炎癥及免疫反應，達到治療干燥綜合征的目的。研究也發現，IL-1、IL-6、TNF-α、脂多糖（LPS）等都可激活JNK通路；另外，毒蕈堿M受體、腎上腺素受體介導的作用途徑等也均可促進AQP5表達，改善SS患者唾液分泌[28]。故不難得出結論：通過調控AQP5及其相關信號通路來治療SS，是目前及未來的重點研究方向。

3.3 AQP5與SS的相關中醫藥研究現狀

既往動物實驗顯示，麥冬多糖可有效降低頜下腺淋巴細胞浸潤度，上調頜下腺AQP5和VIP mRNA的表達，即麥冬多糖對NOD小鼠頜下腺具有保護作用[29]。復方制劑津血源顆粒長期研究的結果提示，其可明顯調高SS模型鼠唾液腺細胞膜AQP5蛋白的表達，且使其分布均勻[30]；進一步研究后認為，津血源增加唾液分泌（養陰生津作用）的機制可能是通過毒蕈堿M受體（尤其是M3受體）、腎上腺素受體介導的作用途徑，增加唾液腺細胞膜AQP5的表達，從而促進唾液分泌。中醫清燥布津法有明顯抑制腺體破壞、改善唾液分泌功能的作用，其作用機制可能與抑制免疫炎癥、促進AQP-5在小鼠頒下腺的表達有關[31]。李碧霞[32]發現，利用烏梅噴霧劑干預2周后，能使大鼠頜下腺AQP5基因明顯過表達，促進水跨膜運動。鐵皮石斛可通過調節SS患者TNF-α、IL-1β和AQP5mRNA的表達，從而改善腺體的淋巴浸潤狀態，因而對SS具有治療作用[33]。白芍總苷可通過上調AQP5及其mRNA的表達，改善NOD小鼠頜下腺的病理損害[34]。甘皂顆粒可通過上調AQP5的表達，降低細胞內Ca2+離子的濃度，抑制SS模型大鼠過度增強的免疫反應，減少頜下腺中淋巴細胞浸潤，緩解炎癥因子浸潤，改善唾液腺分泌功能，從而緩解SS口腔干燥的癥狀[35]。李曉萌等[36]實驗，利用AQP5熒光素酶基因啟動子篩選到的人參皂苷Rb1藥物，證明對AQP5基因有上調作用，并利用動物模型證實Rb1通過促進SS鼠唾液腺的分泌，減輕頜下腺炎癥，上調頜下腺AQP5的蛋白表達，從而改善口腔干燥癥狀。結合動物實驗[37]結果，PCR顯示補骨脂鹽炙后與補骨脂生品比較，AQP5mRNA表達明顯升高（P<0.05），提示補骨脂鹽炙后藥物燥性有所緩解，可能與其對體內AQP的基因表達調控有關。

綜上所述，AQP5在SS炎癥發展、免疫調節、水分子轉運及腺體分泌中發揮重要作用，調控AQP5可能是干燥綜合征藥物治療作用的重要靶點，而上述中醫藥治療SS已有成效，未來有很大研究開發空間，尚需臨床及實驗開發相關阻滯劑或基因替代療法，這可能為許多與炎癥、體液代謝有關的疾病提供治療的新途徑。而關于AQP5其上下游調控機制尚待進一步探討和闡明。