液質(zhì)聯(lián)用法測定川芎茶調(diào)丸中阿魏酸等6種成分的含量

張紅貴 ，陳洪巖 ，孫 曉 ，張小龍 ，，吳啟南 *連云港市第一人民醫(yī)院，連云港 00；連云港市食品藥品檢驗檢測中心，連云港 000；南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 00

川芎茶調(diào)丸具有疏風(fēng)止痛之功效，可用于外感風(fēng)邪所致頭痛及惡寒、發(fā)熱、鼻塞[1]等。其處方由川芎、白芷、羌活、細辛、防風(fēng)、荊芥、薄荷、甘草8味中藥組成。目前，《中國藥典》2015年版第一部收載了川芎茶調(diào)丸的質(zhì)量標準，其僅對制劑中的阿魏酸含量作了質(zhì)控。所見文獻報道的也是運用高效液相色譜法（HPLC）測定該藥中的阿魏酸含量[2]，而其它成分歐前胡素、異歐前胡素、細辛脂素、升麻素苷及5-O-甲基維斯阿米醇苷未測[3-7]，但對人體也有重要的藥理作用。現(xiàn)有文獻對上述6種成分的測定通常是用HPLC法。但是，運用HPLC-DAD法測定時需要達到基線分離，而此時各成分間往往難以完全分離，且耗時較長[8]。液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜具有靈敏度高、選擇性好，且可以在待測組分無需完全分離情況下同時測定等優(yōu)點。本文運用液相串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜測定了川芎茶調(diào)丸中6種成分，為該制劑的生產(chǎn)和使用提供進一步的質(zhì)量控制依據(jù)。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

LC-30高效液相色譜儀（包括SIL-30A型自動進樣器、LC-30AD二元輸液泵、真空脫氣機、CTO-30A柱溫箱），日本島津公司；QTRAP 5500型三重四級桿質(zhì)譜儀 （美國AB Sciex公司）；AG135型十萬分之一電子分析天平 （瑞士Mettler-Toledo公司）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

對照品：阿魏酸（純度99.0%）、歐前胡素（純度99.7%）、異歐前胡素（純度99.4%）、細辛脂素（純度99.8%）、升麻素苷（純度 96.2%）、5-O-甲基維斯阿米醇苷（純度96.1%），均由中國食品藥品檢定研究院提供；川芎茶調(diào)丸 （批號20181104、20181012、20181025，江蘇康緣藥業(yè)）；甲醇、乙腈、乙醇（Germany，Merck）、甲酸（USA，Mreda Technology Incorporation）、甲酸銨（USA，F(xiàn)isher Scientific）均為色譜純；超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 SB C18（2.1 mm ×100 mm，2.7 μm）；流動相：以 0.1%甲酸乙腈-5 mmol·L-1甲酸銨溶液（40∶60）；柱溫：35 ℃；流速：0.3mL·min-1；進樣量：1μL。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧電離源（ESI）；正負離子模式；采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；毛細管電壓為5500V（正離子模式）、-4 500 V（負離子模式），脫溶劑溫度為550℃，氣簾氣壓力為241.3 kPa，霧化器與干燥氣的壓力均為379.2 kPa；離子源所用氮氣純度≥95%，碰撞氣純度≥99.999。6種待測組分的離子對質(zhì)譜優(yōu)化條件見表1。

表1 6種待測組分的離子對質(zhì)譜優(yōu)化條件

2.3 對照品溶液的制備

分別精密稱取阿魏酸、歐前胡素、異歐前胡素、細辛脂素、升麻素苷及5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品適量，用 90%甲醇-甲酸（20∶1）溶解，分別制成498.2、465.0、456.4、400.8、384.8、407.5 μg·mL-1的對照品貯備液；精密吸取上述對照品儲備液各1 mL，置同一 100 mL 量瓶中，加 90%甲醇-甲酸（20∶1）稀釋至刻度，搖勻，制成混合對照品溶液I。

精密量取混合對照品溶液Ⅰ2.5 mL，置100 mL量瓶中，加 90%甲醇-甲酸（20∶1）稀釋至刻度，搖勻，制成每毫升分別含上述成分 124.6、116.2、114.1、100.2、96.20、101.9ng的混合對照品溶液Ⅱ。

2.4 供試品溶液的制備

取本品，研細，精密稱取0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入 90%甲醇-甲酸（20∶1）10 mL，密塞，稱定重量，超聲處理45 min，放冷，再稱定重量，用90%甲醇-甲酸（20∶1）補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。精密量取續(xù)濾液2mL，置100mL量瓶中，加 90%甲醇-甲酸（20∶1）稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.5 陰性對照試驗

按照川芎茶調(diào)丸處方[1]，制成缺川芎、白芷、羌活、細辛、防風(fēng)的陰性對照樣品，按“2.4”項下方法制得陰性對照溶液。精密量取對照品、供試品、陰性對照溶液各1μL，進行測定，色譜圖見圖1。

圖1 對照品溶液及供試品溶液色譜圖 （A）提取離子流色譜圖；（B）疊加色譜圖

2.6 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.3”混合對照品溶液Ⅰ適量，用90%甲醇-甲酸（20∶1）稀釋，配制成阿魏酸濃度為 1 246、622.8、311.4、124.6、62.28、31.14 ng·mL-1， 歐前胡素濃度 1162、581.2、290.6、116.2、58.12、29.06ng·mL-1，異歐前胡素濃度為1141、570.5、285.2、114.1、57.05、28.52 ng·mL-1，細辛脂素濃度為 1 002、501.0、250.5、100.2、50.10、25.05 ng·mL-1，升麻素苷濃度為 962.0、481.0、240.5、96.20、48.10、24.05 ng·mL-1，5-O-甲基維 斯 阿 米 醇 苷 為 1019、509.4、254.7、101.9、50.94、25.47 ng·mL-1，進樣，依法測定其峰面積。以對照品濃度（ng·mL-1）為橫坐標，各對照品峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程，結(jié)果見表2。

2.7 進樣精密度試驗

精密吸取“2.3”項下混合對照品溶液Ⅱ1 μL，按“2.1”及“2.2”項下條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果阿魏酸、歐前胡素、異歐前胡素、細辛脂素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷峰面積的RSD分別為 1.22%、1.00%、1.24%、2.60%、2.29%、1.73%。

表2 回歸方程與線性范圍

2.8 溶液穩(wěn)定性試驗

吸取“2.4”項下供試品溶液（批號20181104）適量， 分別在室溫下放置 0、4、8、12、16、20、24 h，進樣，結(jié)果阿魏酸、歐前胡素、異歐前胡素、細辛脂素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷峰面積的RSD分別為 1.48%、1.21%、1.88%、2.32%、2.12%、1.97%。表明在供試液中待測組分在室溫24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗

精密稱取同一樣品（批號20181104）6份，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣，結(jié)果阿魏酸、歐前胡素、異歐前胡素、細辛脂素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷平均含量分別為 177.9、70.44、213.6、40.20、138.2、96.00μg·g-1，RSD分別 2.08%、1.92%、1.49%、2.14%、2.83%、2.76%。

2.10 加樣回收率試驗

取同一樣品（批號20181104）6份，每份約0.25g，精密稱定，分別精密加入各對照品儲備液適量，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”及“2.2”項下條件進樣，計算得阿魏酸、歐前胡素、異歐前胡素、細辛脂素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷6種成分的平均回收率 （%）及RSD （%），分別為98.50、1.42，104.14、3.73，102.84、0.77，96.38、2.94，99.63、1.71，98.33、2.55（n=6）。

2.11 樣品含量測定

取3批川芎茶調(diào)丸樣品各適量，按“2.4”項下方法分別處理，再按“2.1”及“2.2”項下條件進樣，計算樣品含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果（n=6）

3 討 論

本文考察了3種流動相。通過實驗發(fā)現(xiàn)，以乙腈-5 mmol·L-1甲酸銨溶液為流動相時，阿魏酸、細辛脂素均不出[M+H]+峰，其它待測組分峰響應(yīng)較高。以乙腈-0.1%甲酸為流動相時，阿魏酸、細辛脂素均出[M+H]+峰，但響應(yīng)較低，歐前胡素、異歐前胡素響應(yīng)降低一半左右。以0.1%甲酸乙腈-5mmol·L-1甲酸銨溶液為流動相時，阿魏酸、細辛脂素的[M+H]+峰響應(yīng)依然較低，歐前胡素、異歐前胡素響應(yīng)提高。考慮質(zhì)譜優(yōu)化，最終選擇以0.1%甲酸乙腈-5mmol·L-1甲酸銨溶液為流動相。另外，0.1%甲酸乙腈-5mmol·L-1甲酸銨溶液的比例在40∶60時，6個待測組分能夠基本分開，尤其是歐前胡素與其同分異構(gòu)體異歐前胡素能夠完全分開。

由于阿魏酸的[M+H]+峰在上述3種流動相中響應(yīng)均不是很高，且有阿魏酸在負離子模式下測定的文獻報道[9]，本文采用負離子模式測定阿魏酸。通過實驗可知，阿魏酸的[M-H]-峰響應(yīng)較高，故對阿魏酸采用負離子模式測定。對于細辛脂素，未采用負離子模式測定，因為在質(zhì)譜條件優(yōu)化時，其在負離子模式下，碎片離子峰響應(yīng)很低。通過查閱文獻[10]及實驗得知，其[M+NH4]+峰響應(yīng)較高，故最終在正離子模式下測定細辛脂素的[M+NH4]+峰。

考察了甲醇、乙醇、90%甲醇-甲酸（20∶1）作為提取溶劑，分別用超聲、回流、浸泡過夜法提取樣品，結(jié)果表明，以 90%甲醇-甲酸（20∶1）為溶劑，超聲提取45min效果良好，可將待測組分提取完全。