應用熒光成像技術(shù)研究磷酸鋁凝膠在小鼠胃腸道中的分布

蘇日娜，樊萬君，姚 靜

中國藥科大學 藥學院，南京 210009

磷酸鋁凝膠是一種抗酸劑，能中和胃酸，使胃內(nèi)pH升高，從而緩解胃酸過多引起的反酸、十二指腸潰瘍等癥狀。凝膠劑中的磷酸鋁能形成膠體保護性薄膜，從而隔離并保護損傷組織。有報道稱，選擇膠體次枸櫞酸鉍為對照品、128名患者的臨床治療研究顯示，磷酸鋁凝膠能提高胃內(nèi)pH值至3，胃腸道副作用少，成功緩解胃痛、反酸、燒心的案例所占比分別為90.7%、94.2%和89.7%，有效緩解各癥狀總比率為85%[1]。然而，目前國內(nèi)對于其在胃腸道中的分布研究未見報道。

小動物活體熒光成像技術(shù)可以實時、無損、動態(tài)地監(jiān)測標記物在活體小動物體內(nèi)的分布等[2，3]。相比其他檢測藥物濃度、組織切片等考察藥物分布的方法，熒光成像法更加直觀且方便。本實驗采用熒光成像技術(shù)研究磷酸鋁凝膠（潔維樂?）在禁食小鼠的離體胃腸道中的分布情況，為胃腸道分布研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

磷酸鋁凝膠（潔維樂?）購自韓國保寧制藥株式會社；深紅色碘化物熒光探針DiR購自北京富百科生物技術(shù)有限公司；熒光探針菁染料琥珀酰亞胺酯Cy5購自西安瑞禧生物科技有限公司；水合氯醛購自永華化學科技（江蘇）有限公司。

VISQUE In Vivo Elite小動物活體成像系統(tǒng)（Korea）用于熒光成像；分析軟件為CleVue。

1.2 實驗動物

SPF級ICR小白鼠，雄性，體重為25～32 g，由南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供，許可證號SCXK（蘇）2017-0001。實驗前小鼠禁食 15 h（自由飲水）。實驗過程中對小鼠的處置按照《實驗動物管理條例》的相關(guān)規(guī)定進行，符合動物倫理學。

1.3 潔維樂標記物制備

根據(jù)潔維樂說明書，口服用量為一次20～40g凝膠，換算成小鼠灌胃等效劑量為2.5999～5.1997g·kg-1。

根據(jù)小鼠體重，精密稱取5.1997g·kg-1潔維樂至1mL注射器中，在避光條件下精密加入300 μg·kg-1Cy5（2 mg·mL-1的 DMSO 溶液）或 DiR（10 mg·mL-1的DMSO溶液），與潔維樂混勻即得潔維樂標記物。

1.4 熒光探針的篩選

取禁食小鼠4只，稱重，隨機分為2組（n=2），分別灌胃給予潔維樂DiR標記物和潔維樂Cy5標記物，計時。在灌胃后24 h麻醉小鼠，分別進行小鼠在體熒光成像；隨后立即處死，分別打開腹腔后、取出胃腸道進行熒光成像。熒光成像參數(shù)為：DiR組激發(fā)波長為740～790帶通，發(fā)射波長為810～860 nm長通，曝光時間1 s；Cy5組激發(fā)波長為630～680帶通，發(fā)射波長為690～740nm長通，曝光時間1s。

1.5 考察潔維樂Cy5標記物在小鼠離體胃腸道中的熒光成像情況

取禁食小鼠30只，稱重，隨機分為6組（n=5），灌胃給予潔維樂Cy5標記物，計時。以非標記給藥組為平行對照， 在灌胃后于 0.5、2、4、8、12、24 h 處死小鼠，取出胃腸道，采用小動物活體成像系統(tǒng)進行熒光成像，熒光成像參數(shù)同“1.4”項Cy5組。

1.6 考察潔維樂Cy5標記物在小鼠其他器官（心脾肝腎肺）中的分布情況

禁食小鼠灌胃給予潔維樂Cy5標記物在各個時間點進行胃腸道熒光成像后，同時取出小鼠的其他器官（心脾肝腎肺），采用小動物活體成像系統(tǒng)在相同條件下進行熒光成像。

2 實驗結(jié)果

2.1 熒光探針的篩選

分別灌胃給予潔維樂DiR標記物和潔維樂Cy5標記物的兩組小鼠，在24 h時觀察在體、開腹腔和離體胃腸道熒光成像情況，見圖1。

實驗結(jié)果顯示，由于成像深度有限[4]，在考察限度下，兩組均未觀察到小鼠在體熒光成像情況；而潔維樂Cy5標記物組可更明顯觀察到小鼠開腹腔及離體胃腸道中的熒光成像，故選擇Cy5作為熒光探針。

2.2 考察潔維樂Cy5標記物在小鼠離體胃腸道中的熒光成像情況

圖1 DiR和Cy5潔維樂標記物分別灌胃給藥小鼠在24h時的熒光成像圖

灌胃潔維樂Cy5標記物和平行對照組的小鼠在不同時間點的離體胃腸道熒光成像情況，見圖2。

圖2 灌胃Cy5潔維樂標記物的小鼠在不同時間點的離體胃腸道熒光成像圖（n=5）

熒光標尺從藍色至紅色代表熒光信號由弱至強。實驗結(jié)果顯示，0.5h時潔維樂Cy5標記物已進入腸道內(nèi)，2h開始進入盲腸和結(jié)腸，表明潔維樂在2 h可分布至胃腸道各部位，此后胃、小腸紅色熒光信號開始變?nèi)酰? h開始盲腸和結(jié)腸呈現(xiàn)強烈紅色熒光信號，8 h后盲腸和結(jié)腸紅色熒光信號減弱，24 h時各部位熒光信號均降至最弱。胃內(nèi)熒光信號隨時間的延長呈減弱趨勢，在0.5 h呈強烈紅色熒光信號，24 h呈藍色弱信號或基本無信號；盲腸及結(jié)腸內(nèi)熒光在0.5 h幾乎沒有熒光信號，隨后呈現(xiàn)先增強為紅色強烈熒光信號、而后減弱。

將小鼠離體胃腸道熒光成像圖作進一步分析，采用分析軟件Clevue計算各部位平均熒光強度，繪制胃腸道各部位（胃、小腸、盲腸、結(jié)腸）的熒光強度-時間曲線圖（見圖3）及堆積百分圖（見圖4）。

圖3 灌胃Cy5潔維樂標記物的小鼠胃腸道（胃、小腸、盲腸、結(jié)腸）內(nèi)熒光強度-時間曲線圖*P<0.05，**P<0.01

圖4 灌胃Cy5潔維樂標記物的小鼠胃腸道（胃、小腸、盲腸、結(jié)腸）內(nèi)熒光強度堆積百分比-時間圖

從圖3可知，潔維樂Cy5標記物的小鼠胃內(nèi)熒光強度曲線顯示，隨著時間的延長而呈減弱的趨勢，這是由于潔維樂Cy5標記物灌胃后達到最大量并逐漸進入腸道，因而呈減弱趨勢；小腸內(nèi)熒光強度曲線則是0.5h即顯示較大熒光強度，且在0.5～2h點持續(xù)增強，而2 h后開始逐漸減弱，可以表明潔維樂Cy5標記物在0.5 h已經(jīng)開始進入腸道，且前2 h持續(xù)推進至腸道內(nèi)分布，而2 h后逐漸進入盲腸和結(jié)腸處，從而呈減弱趨勢；盲腸和結(jié)腸內(nèi)熒光強度在0.5h時幾乎忽略不計，而隨著時間的延長呈先增強后減弱，可說明潔維樂Cy5標記物0.5 h還未到達盲腸和結(jié)腸，隨后持續(xù)進入盲腸和結(jié)腸而增強，再逐漸排出體外而呈減弱趨勢。

圖4結(jié)果顯示，潔維樂Cy5標記物在2 h時基本分布至小鼠胃腸道各部位；0.5 h時，胃及小腸所占分布比率最大，隨著時間的延長呈現(xiàn)降低趨勢，而盲腸及結(jié)腸部位分布比率持續(xù)上升，至24 h時主要分布在盲腸及結(jié)腸部位然而，在24 h胃腸道各部位仍有不同程度的潔維樂分布。

2.3 考察潔維樂標記物在小鼠其他器官（心脾肝腎肺）中的分布情況

灌胃用Cy5標記的潔維樂小鼠在各個時間點進行熒光成像后，取出小鼠的其他器官（心脾肝腎肺）進行熒光成像。結(jié)果顯示，灌胃潔維樂Cy5標記物的小鼠其他上述器官內(nèi)均未見熒光顯示，見圖5。

3 討 論

近年來，熒光成像技術(shù)在監(jiān)測腫瘤細胞生長和轉(zhuǎn)移[5]、生物體內(nèi)特定基因的表達[6]、靶向藥物治療效果評價[7]等方面，具有廣泛的應用前景。在口服藥物胃腸道分布研究中，小動物活體熒光成像會有生物組織深度限制和各個小鼠胃腸道在腹腔的位置偏差，而對分布研究有所干擾，因此，選擇離體胃腸道熒光成像，以避免生物組織深度限制，同時達到直觀、實時地觀察藥物在體內(nèi)的分布及停留情況。

本研究基于小鼠體重范圍在30 g左右而導致潔維樂給藥量基本不大于0.2 g，加之灌胃操作時的平行殘留量不可避免，最終選擇較大的灌胃給藥量5.1997g·kg-1，以減小給藥偏差。潔維樂為黃白色凝膠，與水及其他溶劑混合變成混懸液，并緩慢沉淀。因此，制備標記物時，先將熒光染料溶于二甲基亞砜配制成高濃度熒光染料母液，再根據(jù)小鼠體重精密移取300 μg·kg-1熒光染料母液，并與潔維樂混合，以減小溶劑對凝膠性質(zhì)的影響，保證潔維樂呈凝膠狀態(tài)。

本研究應用小動物在體熒光成像系統(tǒng)和熒光染料Cy5成功對磷酸鋁凝膠（潔維樂?）在禁食小鼠的胃腸道中的分布進行了可視化示蹤，可為考察潔維樂胃腸道分布中提供參考。

圖5 灌胃Cy5潔維樂標記物小鼠的其他器官（心脾肝腎肺）在不同時間點的熒光成像圖（n=5）