薤白多糖提取、分離提純及與DNA作用研究

甘楊子，鐘克焱，黃林

（海南醫(yī)學(xué)院，海南海口 571199）

薤白是百合科蔥屬多年生草本植物，別名小根蒜、小根菜等，廣泛分布于東亞地區(qū)。薤白是一種藥食兩用植物，備受中日韓三國人們的喜愛[1]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，薤白味辛、苦，性溫，無毒，具有理氣、寬胸、通陽之功效，常用于心血管疾病組方中[2]。臨床研究顯示，薤白多糖是薤白的主要有效成分，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究顯示其主要成分為果糖、葡萄糖，相關(guān)研究較少。本文探索薤白多糖提取、分離提純方法，并分析其對(duì)DNA作用。

1 材料及方法

1.1 儀器與試劑、實(shí)驗(yàn)材料

藥劑科自購的產(chǎn)自江蘇某地薤白飲片，經(jīng)鑒定為百合科蔥屬植物小根蔥的干燥麟莖。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)4周齡小鼠，嚴(yán)格遵守動(dòng)物倫理規(guī)定，數(shù)量不限。主要儀器：電熱恒溫鼓風(fēng)干燥起、臺(tái)式離心機(jī)、紫外線可見光光度計(jì)、恒溫水浴鍋等。試劑：無水乙醇、牛血清白蛋白胨等標(biāo)準(zhǔn)品，吡啶、鹽酸羥胺等色譜純。

1.2 方法

1.2.1 薤白多糖提取、分離提純

取薤白鱗莖200 g，經(jīng)加熱回流脫脂，獲得薤白粉末156.42 g。參照文獻(xiàn)提出的薤白多糖提取優(yōu)化條件[3]，溫度87.2 ℃，水料比12.2 mL/g，提取3次102 min，合并提取濃縮液，加乙醇定容到40%濃度的薤白多糖乙醇溶液。5 000 r/min離心10 min，-40℃凍干得到粗多糖AMP40及上清液，濃縮上清液去乙醇，加乙醇定容到60%乙醇溶液，離心凍干得粗多糖AMP60及上清液，同法操作得粗多糖AMP80及上清液，棄上清液，最終獲得粗多糖。參照文獻(xiàn)提出的DEAE-52-纖維素交換柱色譜法進(jìn)行初步的分離純化，用葡聚糖凝膠色譜法純化獲得的初步多糖[4]。稱量Sephadex G-100凝膠干粉，加30倍體積的水，粉碎浴5 h冷卻，清洗2～3次，濕法裝柱，水平衡處理24 h備用。取DEAT-52纖維素純化的多糖各20 mg，加2 mL水溶解，濕法上加到SephadeG-100層析柱，洗脫收集各類多糖，在490 nm處吸收值檢測(cè)各類多糖的含量。樣品處理方式分為預(yù)處理、過濾、脫色和透析等多種方式，如已經(jīng)稱重的白色干燥薤白粉末需要用80%的乙醇進(jìn)行2次回流，每次回流時(shí)間為2h，以消除小分子糖、苷類及生物堿等物質(zhì)。過濾過程是對(duì)提取液進(jìn)行減壓抽濾的過程。結(jié)果顯示純化的薤白多糖AMP40-1、AMP40-2、AMP60-1、AMP80-1得率為69.425%、75.340%、62.692%、82.442%，以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制總糖含量的線性回歸方程，計(jì)算AMP80-1的總糖含量最高達(dá)到92.561%～99.195%。采用色譜法、紫外光譜分析薤白多糖成分、純度。多糖含量測(cè)定公式為：

多糖含量=c·V·D/W·V1

在上述公式中，c指代樣品溶液稀釋后所測(cè)得的吸光度對(duì)應(yīng)的濃度（μg/ml）;D為樣品溶液的稀釋倍數(shù)；W為樣品的質(zhì)量，V為水提液定容后的體積。下圖所示的內(nèi)容為未經(jīng)脫色處理的粗多糖色譜圖

圖1 未經(jīng)處理的色譜圖

如圖所示，圖中的刻度值為-0.002、0.000、0.002、0.004、0.006、0.008、0.010與0.012,。橫軸為時(shí)間，縱軸為峰面積。

1.2.2 DNA影響分析

常規(guī)方法分離小鼠股骨BMSCs，將培養(yǎng)的85%BMSC，0.25%胰酶消化吹打后接種到孔板上。將BMSC分為空白組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組（劑量100μL、劑量為12.5、25、50、100 μg/mL）薤白多糖。每個(gè)濃度加入6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)3日后，棄50 μL的培養(yǎng)基。空白對(duì)照組不進(jìn)行輻射，其余輻射處理，2日1次，每次2 Gy，連續(xù)5次。對(duì)照組加生理鹽水。每次輻射都更換相應(yīng)培養(yǎng)基，末次輻射前4 h，加4 mL間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)，末次輻射，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌1次，胰酶消化1 min，加3 mL胎牛血清終止，吹打均勻，轉(zhuǎn)到EP管中，2 000 r/min離心10 min，棄液體加KCl溶液7 mL混勻，37 ℃水浴50 min，加3 mL固定液混勻，2 000 r/min離心10 min，棄上清液，加5 mL固定液，混勻室溫下放置15 min，2 000 r/min離心10 min，加2 mL固定液振蕩混勻，4℃保存72 h。預(yù)冷載玻片，加BMSC后干燥，姬姆薩染色15 min，清水處理，干燥，高倍鏡下觀察分析畸變率，用免疫熒光法檢測(cè)各組細(xì)胞+/16( CDE9 ）焦點(diǎn)簇?cái)?shù)目，分析DNA損傷。

1.3 觀察指標(biāo)

不同組對(duì)象的畸變率、焦點(diǎn)簇?cái)?shù)目。畸變率為畸變數(shù)量在樣本總數(shù)中的所占比例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SPSS20.0軟件統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算，不同組對(duì)象的畸變率、焦點(diǎn)簇?cái)?shù)目多組比較采用F檢驗(yàn)，每組兩兩比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

出峰良好，如圖2所示，

圖2 紫外譜圖

根據(jù)本次研究的研究結(jié)果，AMP40-1、AMP40-2、AMP60-1、AMP80-1均未見吸收峰，提示不含有核酸、蛋白質(zhì)，提示為單純的多糖組分，證實(shí)多糖中含有阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖。空白組、對(duì)照組、不同濃度的薤白多糖溶液處理的實(shí)驗(yàn)組的畸變率、焦點(diǎn)簇?cái)?shù)目隨著薤白濃度的上升呈逐漸下降趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組畸變率、焦點(diǎn)簇?cái)?shù)目低于空白組、對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）見表1。

3 討論

薤白多糖提取、分離提純方法基本成熟，本次研究中采用分布沉淀法進(jìn)行薤白多糖分離提純后，提取物未見吸收峰，經(jīng)鑒定多糖中主要成分為阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖，與其他文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相似[4-5]。

目前有關(guān)多糖與DNA的研究主要集中在其對(duì)NDA的保護(hù)作用，本次研究也顯示空白組、對(duì)照組、不同濃度的薤白多糖溶液處理的實(shí)驗(yàn)組的畸變率、焦點(diǎn)簇?cái)?shù)目差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示薤白多糖處理可以降低細(xì)胞的畸變率，這可能有助于降低惡性腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。有報(bào)道顯示薤白多糖還可以與DNA進(jìn)行相互作用，水相中的DNA與抗癌藥物相互作用，可嵌入到雙螺旋DNA的堿基對(duì)，形成復(fù)合物[6]。該多糖還通過影響磷酸化修飾、抗氧化活性，發(fā)揮DNA保護(hù)作用。不同類型的薤白多糖對(duì)DNA的作用不盡相同，今后還需進(jìn)行薤白多糖的不同成分研究，以更好的挖掘薤白多糖的藥用學(xué)價(jià)值。

表1 空白組、對(duì)照組、不同濃度的薤白多糖溶液處理的實(shí)驗(yàn)組的畸變率、焦點(diǎn)簇?cái)?shù)目對(duì)比（±s）

表1 空白組、對(duì)照組、不同濃度的薤白多糖溶液處理的實(shí)驗(yàn)組的畸變率、焦點(diǎn)簇?cái)?shù)目對(duì)比（±s）

分組 空白組 對(duì)照組 12.5μg/mL 25μg/mL 50μg/mL 100μg/mL畸變率（%） 18.33±4.93 22.33±4.72 16.56±3.56 15.40±3.41 14.18±3.32 13.08±3.17焦點(diǎn)簇?cái)?shù)目（個(gè)/100） 265.18±29.46 281.59±45.60 221.10±48.15 190.49±37.24 172.00±35.79 168.58±34.65

4 小結(jié)

薤白多糖提取、分離提純質(zhì)量尚可。薤白多糖可以減輕放射引起的細(xì)胞DNA損傷，發(fā)揮保護(hù)作用，且呈劑量依賴。