5’-鳥苷酸二鈉脫色結晶的方法研究

杜衛群，程洪杰，邱蔚然

（南通秋之友生物科技有限公司，江蘇南通 226200）

鳥苷酸二鈉（簡稱GMP·2Na）具有香菇樣鮮味，是廣泛應用于食品行業的鮮味添加劑，也可用于制備營養強化劑、代謝調節劑、情緒穩定劑等[1]。

在20世紀80年代，韓國、日本早已開始工業規模生產呈味核苷酸二鈉系列產品，其產品品質高，在我國市場和價格競爭中占據了優勢地位。而目前我國產品存在的色澤、晶型、易結團等缺陷，成為生產企業的劣勢，無法與外國企業競爭。

針對以上問題，本研究通過活性炭和離子交換脫色，降低產品色度，并優化結晶條件，提高晶型的均一性和產品質量，使其達到國際先進水平。

1 材料與儀器

1.1 材料

鳥苷酸二鈉粗品，由南通秋之友生物科技有限公司自制；鳥苷酸二鈉晶種，購自希杰（聊城）生物科技有限公司；95%乙醇、氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉，均購自國藥集團化學試劑有限公司；強堿陰離子交換樹脂，購自上海金開樹脂有限公司；1#（303型）、2#（303型）、3#（767型）活性炭，購自南通濱海活性炭有限公司；4#（303型）、5#（767型）活性炭，購自南京佳力炭業有限公司。

1.2 儀器

PHS-25型實驗室pH計（上海般特儀器有限公司）、UV-7504單光束紫外可見分光光度計（上海欣茂儀器有限公司）、XSP-BM-3CA光學顯微鏡（鄭州巴立科技有限公司）、紅外快速干燥箱（鞏義市予華儀器有限責任公司）、HL-2恒流泵、CBS-A程控全自動部份收集器（上海青浦瀘西儀器廠）、FE30電導率儀[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]、DZF真空干燥箱（上海博訊實業有限公司）。

2 實驗方法

2.1 活性炭脫色條件研究

配制100g/L的GMP粗品溶液，待溶解完全后用硅藻土過濾，去除溶液中的不溶性雜質。測定pH值、A430、A280。各取100mL溶液，不加氯化鈉，加入1g活性炭，在60℃保溫1 h后用硅藻土過濾，測定濾液A430、A280。計算GMP回收率及脫色率。

公式中，FA280表示濾液A280；SA280表示初始溶液A280；Vs表示初始體積；Vf表示濾液體積FA430表示濾液A430；SA430表示初始溶液A430。

實驗組一：活性炭種類，分別加入1#、2#、3#、4#、5#活性炭；實驗組二：活性炭量加入量，分別加入0.5g、1.0 g、1.5g活性炭；實驗組三：脫色時間，分別反應0.5h、1.0 h、1.5h；實驗組四：氯化鈉加入量，分別加入3g、5g、7g氯化鈉。

2.2 陰離子交換樹脂脫色

2.2.1 靜態法樹脂用量探究

各取100mL濃度為100g/L GMP溶液，分別加入濕體積0mL、5mL、10mL、15mL、20mL、25mL的氯型強陰離子樹脂，放入搖床中振蕩混勻。反應2h后，用硅藻土過濾，計量體積，測定濾液A430、A280。按2.1中公式計算脫色率及回收率。

2.2.2 動態法鹽濃度影響探究

在直徑1.1cm層析柱中裝入約30mL氯型強陰離子交換樹脂，各取3根。各取300mL濃度為100g/L GMP溶液，分別加入0g、1.5g、3.0 gNaCl（即鹽濃度分別為0、0.5%、1%），溶解后上樣。流速30mL/h，收集流出液。計量體積，測定濾液A430、A280。計算脫色率及回收率。

2.3 GMP脫色率及結晶過程參數優化

GMP·2Na結晶反應裝置如圖1所示。取120g/LGMP溶液，加入5%NaCl（100mL溶液中含5gNaCl），調節pH9.0。將溶液平均分為若干份，取100mL倒入250mL三頸瓶，保持40℃水浴溫度，轉速300 r/min，充分攪拌0.5h，逐滴加入95%酒精使其渾濁，加入質量分數3%GMP晶種，養晶1h。之后補加95%酒精至100mL，調節轉速至300 r/min，期間取樣用顯微鏡觀察晶形變化，記錄結晶過程時間。待完全轉化后，降至室溫，繼續攪拌30 min。抽濾，先用75%乙醇浸泡30min，再用 95%乙醇淋洗。抽濾后置于紅外烘箱下干燥，測量母液體積和濃度。

圖1 GMP·2Na結晶反應裝置圖

2.3.1 溫度對GMP.1Na結晶影響

水浴溫度分別保持40℃，50℃，60℃，以及先水浴溫度保持40℃、加完酒精后升至60℃。

2.3.2 pH對GMP·2Na結晶影響

初始pH分別調至8.5、9.0、9.5。

2.3.3 酒精加入量對GMP結晶影響

養晶結束后，酒精加入量補加量分別為料液體積的 0.5、0.75、1、1.25 倍。

2.3.4 酒精滴加速度對GMP·2Na結晶影響

酒精滴加速度分別為860mL/h、430mL/h、80mL/h。

2.3.5 攪拌速度對GMP·2Na結晶影響

結晶攪拌速度分別為100 r/min、200 r/min、300 r/min、400 r/min。

2.4 鹽析劑加入量

實驗過程同2.3，只改變鈉鹽種類及加入量。實驗組一：一價鈉鹽，分別加入5%氯化鈉、甲酸鈉、乙酸鈉；實驗組二：二價鈉鹽，分別加入5%碳酸鈉、硫酸鈉、四硼酸鈉、磷酸氫二鈉；實驗組三：三價鈉鹽，分別加入5%、7%、9%磷酸鈉；實驗組四：混合鈉鹽，料液中加入氯化鈉、磷酸鈉的比例分別為1.5∶3.5、2.5∶2.5，3.5∶1.5。

3 結果與分析

3.1 活性炭脫色條件研究

鳥苷酸遇酸即會生成穩定的凝膠物，且不易溶解，僅在高溫或強堿條件下會再溶解，因而不宜用酸調pH后一般的活性炭脫色。從圖2-a可知，活性炭脫色后，無較大樣品損失，相對而言，4#活性炭脫色效果最佳；由圖2-b、2-c可知，加入1%活性炭，60℃保溫0.5h，脫色率高，回收率也較好；由于加入鹽之后會使pH下降，同時改變樣品與色素離子化程度，因而加入一定量的NaCl也能提高脫色效果及回收率，圖2-d顯示，5%NaCl鹽濃度時脫色效果最佳。綜上，針對GMP采用活性炭脫色最佳條件為加入5%NaCl，攪拌溶解后，加入1% 4#活性炭，60℃保溫0.5h，脫色效果及回收率最佳。

3.2 強堿陰離子交換樹脂脫色

3.2.1 靜態法樹脂用量探究

由圖3可知，加入陰樹脂后，色素可被大量吸附，較活性炭更佳，表明大部分色素為陰離子型色素，但同時也吸附了部分GMP。綜合考慮，樹脂與GMP重量之比為1時，脫色率和回收率均較好。

圖2 活性炭脫色條件影響

圖3 陰離子交換樹脂量影響

圖4 鹽濃度影響

3.2.2 動態法鹽濃度影響探究

相較于靜態法，柱層析法樹脂與物料接觸更完全且時間長，因而脫色效果更佳。由圖4可知，脫色率最高可達到80%。同時增加NaCl加入量，可減少GMP的吸附，提高回收率，但與此同時，也降低了脫色效率。為達到最佳效果，應降低料液含鹽量，提高脫色率，而少量被樹脂吸附的GMP樣品，可通過調節洗脫液鹽濃度，回收部分色素低的GMP。最終提高洗脫強度將樹脂再生。

3.3 GMP·2Na結晶過程參數優化

3.3.1 溫度對GMP·2Na結晶影響

據文獻報道，當微小晶體與較大晶體同時存在于溶液中時，如果溶液對較大晶體是飽和的，對小晶體則未飽和，于是小晶體先溶解，然后在大晶體表面上重新析出，促進晶體長大。晶體比表面積變小，使附著在晶體表面的雜質減少，因而，在制備工藝允許的情況下，適當提高反應溫度，有利于獲得較大而均勻的晶體[1]。由圖5可以看出，隨著溫度的上升，晶形棱角更明顯且更粗壯，但溫度過高增大溶解度會降低收率。

圖5 溫度對晶習的影響

3.3.2 pH對GMP·2Na結晶的影響

結晶溶液pH值會直接影響結晶物質的溶解度、亞穩區以及結晶[2]。5’-鳥苷酸分子中同時含有酸性（磷酸）和堿性（鳥嘌呤）基團，屬于兩性化合物，其溶解和微觀解離性質與氨基酸非常相似，pH值增大會增大GMP的溶解度。當pH=9.5時，收率降低很明顯，而且結晶后產品溶液pH＞8.5，產品不合格。在結晶過程中，隨著pH升高，晶習粒度增大、長度增加，逐漸由短棒狀轉變為長棒狀，如圖6所示。其原因是，pH升高可提高5’-鳥苷酸二鈉的形態轉化速率，在其他條件相同的條件下延遲了晶體生長的時間；另外，溶解度的增大使得相應的過飽和度將會減小，這樣會使結晶過程更容易控制在介穩區內進行，從而更有效地避免突變二次成核現象的發生，進而使產品的粒度增加。同時兼顧到收率和晶習，pH=9.0時是較好的結晶條件。

圖6 pH對晶習影響

3.3.3 酒精加入量對GMP·2Na結晶的影響

有些企業選擇甲醇作為溶析劑，但甲醇毒性較大，歐美國家已逐步限制甲醇用于食品加工助劑。本研究直接采用食用酒精，更為安全。由圖7可以看出，隨著酒精加入量的增加，長寬比明顯降低，有從細長針狀轉化為長棒狀的趨勢，同時收率會明顯增加。因為GMP微溶于酒精，酒精越多析出的GMP越多，由無定形轉化的晶習也越多，但過多時溶液中的雜質也易析出，降低含量。當酒精是料液的1.25倍時，轉化出的晶習會結團，難抽濾。GMP的結晶過程是先析出無定形，隨著溶劑中溶析劑含量的增加，到達某一值后（文獻報道為≥0.5）無定形粘附于晶種表面慢慢轉化為晶體。晶體越多，這一過程被逐漸加速。從圖7可知，選取酒精倍數為0.75時條件較合適。

圖7 酒精加入量對晶習的影響

3.3.4 酒精滴加速度對GMP·2Na結晶影響

由圖8可知，酒精滴加速度對晶形和收率沒有明顯的影響，原因可能與5’-鳥苷酸二鈉特殊的結晶過程有關。5’-鳥苷酸二鈉溶析結晶過程中，隨著溶析劑的滴加，首先沉淀析出的固體為無定形，之后隨著溶析劑的不斷加入，溶劑配比發生改變，無定形轉化為晶體。因此晶體成核和生長過程的過飽和度與無定形5’-鳥苷酸二鈉的溶解速度直接相關，而與溶析劑的滴加速度關系不大。也就是說無定形5’-鳥苷酸二鈉的形成對結晶過程起到了一定的緩沖作用，使溶析劑滴加速率對結晶過飽和度沒有直接的影響。由此可以得出，溶析劑滴加速度不是影響晶體的主要因素。

3.3.5 攪拌速度對GMP·2Na結晶影響

攪拌速率對結晶的快慢、晶體的晶型都有影響。結晶時，緩慢冷卻并輕微攪動或不攪動，得到的過飽和溶液會形成較寬的亞穩區，使結晶誘導時間顯著延長，能形成顆粒均勻且較大的晶體。相反，當溶液達到飽和后，攪拌速率增大可使亞穩區變窄，相對過飽和增大，成核速率大于晶體生長速率，得到顆粒產品；同時攪拌速率的增大使顆粒與顆粒之間、顆粒與攪拌槳之間以及顆粒與結晶容器壁之間的碰撞率增加，更易造成二次成核現象的發生，形成更加細小的晶體顆粒。由圖9可知，攪拌速率對晶體形貌及平均粒徑有顯著的影響，隨著攪拌速率增大，晶體粒徑大小呈現先增大后減少的趨勢。隨著攪拌速率增大，產品中部分晶體顆粒可能因為過大的攪拌力度而破碎。適宜強度的攪拌不但可以防止顆粒沉淀劑聚積現象的發生，同時亦不會因攪拌強度過大而使晶體破碎。因此，攪拌速率在250 r/min左右有助于晶體的生長與轉化，且能夠有效防止顆粒的聚積和碎晶的出現。

圖8 酒精滴加速率對晶習的影響

圖9 攪拌速度對晶習的影響

3.4 GMP·2Na結晶添加劑的影響

由圖10可知，一價鹽中用氯化鈉結出的晶體為長條棒狀，在溶液中晶習合適且多為文獻[3]所報道的形狀，但在抽濾過程中容易結團，干燥時間較長；加入甲酸鈉攪拌過夜后仍為大量的無定形；加入乙酸鈉晶體過細，轉化過慢。

二價鹽中加入碳酸鈉結出的晶形成方塊狀，由于鹽析作用，會降低GMP濃度，提高收率，同時碳酸鈉會阻礙色素析出，使產品顏色較淺。但碳酸鈉和硫酸鈉在酒精中溶解度低，易析出而帶入產品中，使得產品含量降低。四硼酸鈉作用下結出的晶體太細小，磷酸氫二鈉作用下沒有無定形轉化。

陰離子中電荷價越高，鹽析效應越顯著，磷酸鈉作為三價的鹽，三價磷酸根會表現出較強的鹽析作用，會顯著降低GMP溶解度，提高最后結晶收率。在磷酸鈉作用下，GMP析出后先聚結為小團塊，然后小團塊慢慢結成一個晶體，磷酸鈉使晶習由原先的長棒狀改變為六邊形狀。磷酸鈉的另一個顯著優勢是結晶出的產品蓬松，很容易抽濾與干燥，解決了產品干燥困難、耗時長、能耗高的問題。

圖10 各種鈉鹽對晶習的影響

鑒于加入磷酸鈉后GMP的結晶收率比只加氯化鈉的結晶收率高10～15個百分點，且磷酸鈉可以很好地克服抽濾難的問題，將氯化鈉和磷酸鈉混合加入，在保證一定晶形的基礎上，收率也明顯提高。觀察圖11，隨著氯化鈉量的增加，晶體逐漸變大且均勻；隨著磷酸鈉量的減少，轉化時間逐漸增長，抽濾慢。磷酸鈉、氯化鈉的比例為2.5∶2.5時，兩種鹽相應相當，產生的效果最佳。同時探究了不同加入總量，鹽越多，結晶時間越短，因磷酸鈉作用更明顯，收率也越高。但過量含量會不達標。總量在5g時，各項指標均合適。

圖11 不同氯化鈉磷酸鈉比例對晶習的影響

4 討論

色素分為離子型和非離子型兩大類。非離子型可通過活性炭、氧化還原法等去除，有研究者嘗試過利用過氧化氫、保險粉等氧化還原的方法去除色素，但該GMP·2Na本身產生容易被氧化產生微量降解，影響質量。鳥苷酸本身理化性質受限，在酸性條件下會膠化，因而本文篩選了在中性條件脫色的活性炭，對其條件進行了優化[4]，并通過加入鹽提高脫色率，后續結晶工藝銜接，最終脫色率可達40%左右。對于離子型的色素，離子交換法憑借反應條件溫和，不失為一種理想的選擇[5]。通過預實驗，選擇效果較好的強堿陰離子交換樹脂。本文對其樹脂用量、流速、上樣鹽濃度等參數進行了探索，確定樹脂與鳥苷酸質量之比為1，流速為1個空間流速，外加0.5%的鹽，即可達到70%的脫色率，回收率約90%，少量被吸附的GMP，最后利用3%NaCl的即可洗脫。流出液經活性炭脫色，微濾，可進一步降低色素，可直接結晶。經若干次40L中試放大驗證，方法可行。但若料液本身色素含量高，需多次脫色，才能符合要求。另外由于工序時間較長，料液在室溫易長菌，需考慮后續結晶工序銜接。

對于GMP·2Na結晶，本文研究了溶析結晶結合鹽析結晶。與一般溶析結晶不同，由于GMP·2Na本身性質特殊，其經歷了無定形產生和溶解的動態過程，因而溶析劑滴加速率對其基本無影響。據實驗結果顯示，pH、溫度、酒精加入量是影響晶習大小和收率的顯著因素，攪拌速率影響晶習大小和轉化時間。為使產品符合標準，同時提高收率，縮短結晶時間，選擇40℃為結晶工藝溫度，pH=9.0，酒精加入量為0.75倍，攪拌速度為250～300 r/min時效果最佳。添加劑不僅影響晶習大小，同時影響晶習形狀[6-7]，而晶習又與后續抽濾、干燥相關。5’-GMP·2Na屬多晶型物質，除無定形外，共4種晶型，含水量各有差異。從結果來看，加入氯化鈉越多晶習最粗大，但抽濾易結團，且由于鹽溶效應，收率低。而加入碳酸鈉得到方塊狀晶體，且顏色白，但易結團且pH高。加入磷酸鈉得到六棱柱形晶體，雖小但易抽濾干燥。最終綜合氯化鈉和磷酸鈉兩種鈉鹽優勢，得到收率高、晶習適中，易抽濾干燥的產品。本文涉及的脫色結晶方法不僅有效解決了工藝化中GMP·2Na產品遇到的問題，也可給其他類似產品提供了借鑒。