不同生長時期加拿大一枝黃花抑菌效果

陳晶晶

（浙江舟山群島新區(qū)旅游與健康職業(yè)學(xué)院，浙江舟山 316111）

加拿大一枝黃花（Solidago canadensis L）原產(chǎn)于北美，在20世紀(jì)70年代引入我國，屬菊科一枝黃花屬，目前已在我國華東地區(qū)發(fā)展成為一種廣泛分布的外來雜草[1]。該物種繁殖力強(qiáng)，已嚴(yán)重影響當(dāng)?shù)刂参锛稗r(nóng)作物的生態(tài)的平衡。國外研究報道其具有抑菌、抗氧化作用，作為藥用植物已經(jīng)具有100多年的歷史[2-3]。國內(nèi)對加拿大一枝黃花的藥用價值研究逐漸關(guān)注，例如李紅軍等[4]以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等6種供試菌作為研究對象，研究了加拿大一枝黃花葉提取物的抑菌性、最低抑菌濃度及與一些抗菌藥品的抑菌性比較。結(jié)果表明：加拿大一枝黃花葉提取物對6種供試菌均有一定的抑制作用。但目前國內(nèi)相關(guān)報道大多關(guān)注對加拿大一枝黃花某一部位單一性抑菌比較，對于不同時期和不同部位提取物的抑菌比較鮮有報道，本文通過對加拿大一枝黃花的花前期根、枝葉和花期根、枝葉和花進(jìn)行抑菌性多項比較，探究它們的抑菌效果，并在此基礎(chǔ)上，選取最有效的抑菌部分作抑菌原理探究，為探究加拿大一枝黃花基礎(chǔ)研究提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus），由當(dāng)?shù)丶部刂行膶嶒炇姨峁?/p>

加拿大一枝黃花全株采集于野外，花前期植株采摘7—8月，花期采摘10—11月，不同生長期植株的根、枝葉、花分開處理，陰干備用。

瓊脂培養(yǎng)基和肉湯培養(yǎng)基，北京路橋技術(shù)有限公司；立式萬用電爐，上海慧泰儀器有限公司；SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺，上海博訊有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；S-3400N掃描電子顯微鏡，日本日立等。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取物制備

稱量不同植株樣品干品50 g，加入95%乙醇500 mL，放于4 ℃的冰箱內(nèi)，密封，浸漬，24 h后，低頻超聲處理30 min，過濾。殘渣按照1∶10比例添加95%乙醇，如上處理，反復(fù)提取3次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓至適量，獲取樣品。取適量樣品，加入生理鹽水，配比濃度約為1 g/mL，高壓滅菌備用。

1.2.2 菌懸液的制備

將以上菌株接種在肉湯增菌液中，設(shè)置恒定37℃，搖床培養(yǎng)3代，取10 mL到無菌離心管中。設(shè)離心機(jī)溫度為4 ℃，4500 r/min離心10 min。取出離心后溶液，棄上清液，加入10 mL無菌磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)緩沖液（pH=7.2），輕輕搖勻，封口，備用。同時做菌懸液細(xì)菌總數(shù)測定，每個試驗對象重復(fù)3次。

1.2.3 提取物對致病菌抑菌試驗

用移液器分別吸上述加拿大一枝黃花不同提取物9 mL于試管中，迅速吸取1 mL備用菌懸液加入試管中，稍許振蕩，2 h后，用移液器吸取1 mL溶液，轉(zhuǎn)移到含有9 mL無菌生理鹽水的試管中，稀釋102～104梯度，進(jìn)行細(xì)菌總數(shù)測定，生理鹽水組作為對照組，每個試驗對象重復(fù)3次。

1.2.4 提取物抑菌掃描電鏡

選取抑菌效果明顯一組，進(jìn)行電鏡掃描實驗。參照1.2.3方法，獲取抑菌后液體，用2.5%的戊二醛進(jìn)行固定后，按照梯度脫水處理，進(jìn)行CO2超臨界、噴金鍍膜處理后，采用S-3400N掃描電子顯微鏡進(jìn)行拍照處理，同時將未經(jīng)任何處理的菌懸液同上制備作為對照組。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用軟件SPSS18.0進(jìn)行方差分析，顯著性水平設(shè)置為p＜0.05。數(shù)據(jù)結(jié)果取平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與討論

2.1 加拿大一枝黃花不同時期不同部位的抑菌比較

從表1看出，加拿大一枝黃花的花期前、花期不同的部位提取物對4種不同菌種有一定的抑制作用。同一種提取物對不同菌種抑菌效果不同，其中金黃色葡萄球菌抑制效果最弱，其他4種菌種的抑菌效果差異性不顯著。花期前不同部位相比較，枝葉提取物抑菌效果優(yōu)于根部提取物。花期不同部位相比較，花提取物抑菌效果最強(qiáng)，枝葉提取物抑菌效果次之，根部提取物最弱。5種不同的提取物抑菌效果，花期抑菌效果最強(qiáng)，枝葉部分提取物抑菌效果次之，根部的抑菌效果最弱，其中兩種不同時期的根部抑菌效果都不太理想，這可能和根部質(zhì)地堅硬，有效物質(zhì)成分提取不充分，導(dǎo)致有效抑菌成分偏低。枝葉提取物在不同生長時期，表現(xiàn)的抑菌效果差別不顯著。綜合分析，選用加拿大一枝黃花的花部分提取物進(jìn)行電鏡掃描觀察試驗。

表1 加拿大一枝黃花不同部分提取物對菌懸液的殺菌效果

2.2 加拿大一枝黃花提取物處理后細(xì)菌電鏡掃描

在圖1～3中，圖A、B、C分別是大腸桿菌、副溶血弧、枯草芽孢桿菌未經(jīng)處理情況下的電鏡掃描圖，圖a、b、c分別是大腸桿菌、副溶血弧、枯草芽孢桿菌的經(jīng)過加拿大一枝黃花提取物處理后的電鏡掃描圖。從圖A、B、C可以看出，未經(jīng)處理的三種菌體飽滿、光滑，形態(tài)完整。圖a、b、c可以看出經(jīng)過處理后，三種微生物的菌體的形態(tài)發(fā)生改變，表面發(fā)生褶皺，菌體聚集，有凝聚現(xiàn)象。有關(guān)研究報道通過對加拿大一枝黃花精油成分分析，加拿大一枝黃花含有多種抑菌成分，包括α-蒎烯、檸檬烯、大香葉烯D等，其中所占比重最大是大香葉烯D[5-8]。因此推斷在加拿大一枝黃花乙醇提取物中也含有多種抑菌成分。圖a、b、c菌體改變，可能是這些抑菌成分共同作用，改變了菌體細(xì)胞膜的通透性，細(xì)胞內(nèi)液溢出。

圖1 處理前后大腸桿菌變化的掃描電鏡圖

圖2 處理前后副溶血弧菌變化的掃描電鏡圖

圖3 處理前后枯草芽孢桿菌變化的掃描電鏡圖

3 結(jié)語

（1）不同的生長時期的加拿大一枝黃花各部分的提取物對金黃色葡萄球菌、肉芽枯草桿菌、副溶血弧菌、大腸桿菌都表現(xiàn)出一定的抑菌效果，根部提取物抑菌效果最弱，花提取物最顯著，可能花部分含有抑菌成分較高的有關(guān)。

（2）加拿大一枝黃花花部分提取物抑菌效果電鏡掃描觀察，菌體皺縮，聚集成團(tuán)，可能是有效抑菌成分增加菌體細(xì)胞膜通透性，細(xì)胞內(nèi)液溢出導(dǎo)致。