水酶法提取微藻油脂的研究

林偉國，吳沖沖，宗明生，謝婧新，于鵬，榮峻峰

（中國石化 石油化工科學研究院，北京 100083）

由于化石能源的逐漸減少和環境污染的日益嚴峻，人們迫切需要尋找新的清潔能源來替代傳統能源。生物柴油具有環保性能好、發動機啟動性能好、燃料性能好、原料來源廣泛等特性，被視為主要的替代能源之一。目前，微藻是最具潛力的第三代生物能源原料，具有油脂含量高、生長速度快、不與糧食競爭、能產生多種高附加值產物、可消耗環境中的CO2等優點[1-3]。近年來，微藻生物柴油技術引起了國內外學者的廣泛關注[4-5]，但由于成本及能耗高等原因，至今仍難達到規模化生產[6]。在微藻生物柴油的生產工藝中，油脂提取是關鍵環節之一，因此研發具有高效節能的油脂提取技術是降低成本的有效途徑之一[7-8]。

微藻體積小且具有細胞壁結構，細胞破碎一直是目前利用微藻培養和提取微藻油脂的難點之一[9]。目前，微藻破壁提油常用的方法有物理法、化學法、生物法[10-12]。物理法包括高速高壓均質法、超聲法、反復凍融法等，這些方法各有優缺點，可以根據對最終產品需求的不同采用不同工藝提取微藻油脂。化學法常用的有機溶劑提取法雖較為溫和，但所需時間長，且對部分堅硬藻油脂提取率較低[13]。生物法中水酶法是在水相中利用相關酶水解細胞壁，從而使油脂游離出來。該方法操作條件溫和，安全，污染少，生產過程能耗低，所得到的油脂質量較高，生物相容性好，易于精煉，也可以用于處理濕藻，微藻采收后無需干燥，大大降低了能耗[14-16]。

本研究選用難以破壁提取油脂的微擬球藻和小球藻為研究對象，采用酸堿預處理與水酶法酶解微藻細胞相結合，高效提取微藻油脂，并考察了不同萃取溶劑對油脂提取率和提取油脂種類的影響，為微藻生物質的綜合利用提供技術支持。

1 實驗部分

1.1 樣品與試劑

微擬球藻，煙臺海融生物技術有限公司養殖；小球藻，石油化工科學研究院微藻實驗室養殖；冰醋酸、乙醇、NaOH、三氯甲烷、正己烷，分析純，購自北京化工廠；2 000 IU /g纖維素酶、20 000 IU/g果膠酶、50 000 IU/g酸性蛋白酶，購自北京鴻潤寶順科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 微藻油脂的提取

（1）水熱法（酸熱法）。稱取3 g微藻干粉于燒杯中，加入30 mL水，攪拌均勻，加入濃鹽酸控制反應體系中鹽酸濃度為1 mol/L，在80 ℃下水浴加熱2 h，降至常溫，加入30 mL三氯甲烷萃取其中的微藻油脂，干燥脫除有機溶劑后得到微藻油脂。

（2）超聲法。稱取3 g微藻干粉于燒杯中，加入50 mL水，攪拌均勻，在冰浴條件下超聲破碎，超聲功率為800 W，超聲時間為3 s，間歇5 s，處理15～30 min，再加入30 mL三氯甲烷萃取其中的微藻油脂，干燥脫除有機溶劑后得到微藻油脂。

（3）索氏抽提法。取稱取3 g微藻干粉，研磨后轉移至濾紙筒放入抽提器內安裝妥當，注入抽提溶劑三氯甲烷至虹吸管高度以上，待抽提液流凈后，再加入混合液至虹吸管高度的2/3處。用脫脂棉塞入冷凝管上口，打開冷凝管進水管，加熱抽提。每小時回流7次。抽提8 h以上，至抽提管內的混合液無油跡為止。回收混合液，取下冷凝管和抽提筒，加熱除盡抽提瓶中殘余的混合液，將抽提瓶在105 ℃溫度下干燥至恒重，抽提瓶增加的量即為微藻總脂的量。

（4）水酶法。稱取3 g微藻干粉于燒杯中，加入10 mL水，攪拌均勻，用氫氧化鈉調節pH到9，把藻液放入氧彈中，設置旋轉烘箱溫度為80～100 ℃，反應8 h。之后從旋轉烘箱中取出氧彈，把藻液移入燒杯中，用醋酸調節pH到5，按照每種酶200 IU/g（微藻）的量加入纖維素酶、果膠酶、酸性蛋白酶中的一種或者兩種、三種組合，把藻液重新放回氧彈，在旋轉烘箱內于50 ℃下反應10 h。反應結束后用有機溶劑萃取微藻油脂，干燥脫除有機溶劑后得到微藻油脂。

1.2.2 微藻油脂中可皂化物和不可皂化物的測量

準確稱取干燥的微藻油脂樣品約5 g（準確至0.000 1 g），記錄其質量m1，放于斜三口圓底燒瓶中，加入1 mol/L的KOH-95%乙醇溶液50 mL，攪拌下加熱回流2 h，皂化微藻油脂中的可皂化物；加入蒸餾水20 mL，冷卻后加入25 mL正己烷分2次洗滌燒瓶，萃取分離皂化液中的不皂化物，萃取液用蒸餾水洗滌2次，并將洗滌水與斜三口圓底燒瓶中的萃余液合并，蒸出合并液中的乙醇，至燒瓶中無氣泡為止；在60 ℃下用1.5 mol/L HCl溶液50 mL酸化合并液，反應時間為30 min，然后靜置冷卻；將酸化后的溶液轉移至分液漏斗中，用20 mL正己烷洗滌燒瓶2次，并將洗滌液移入漏斗中靜置分層，將下層甘油酸水轉移到另一個500 mL分液漏斗中，加20 mL正己烷進行萃取，如此萃取2次后，將得到的正己烷溶液合并于一個分液漏斗中，用50 mL去離子水洗滌得到的脂肪酸，直至洗液加甲基橙指示劑不變色為止；將得到的脂肪酸正己烷溶液轉移至旋轉蒸發儀中，蒸發回收正己烷，干燥脂肪酸得到微藻油脂中可皂化的總脂肪酸質量（記錄其質量m2）。

總脂肪酸含量（F）計算：

2 結果與分析

2.1 微藻油脂含量的標定

對微擬球藻和小球藻分別采用水熱法、超聲法和索氏提取法進行微藻油脂的提取，兩種微藻得到的微藻總脂含量見表1。

從表1可以看出，采用不同方法提取的微藻油脂含量差異較大，分析原因，主要是不同方法對微藻的破碎提取效率有所差異，其中以索氏抽提法得到的微藻油脂含量最高，水熱法次之，超聲法最低。另外，不同批次的微藻油脂含量有所不同，這是因為微藻的養殖環境，如氮源、生長溫度、營養鹽等因素都對微藻中油脂的含量及組成有較大影響，由于原料的生產及供應條件，在以后的實驗中使用序號為1、3的微藻作為實驗原料。其中由于采用索氏抽提法提取的油脂較為充分，因此在以后的微藻油脂提取實驗中均將水酶法提取到的微藻油脂與索氏抽提法提取的微藻油脂作對比。

2.2 纖維素酶對微藻油脂提取的研究

在微藻細胞壁中，內外層中均存在大量的纖維素及半纖維素等，纖維素酶可以降解微藻細胞壁中的纖維素骨架，崩潰細胞壁，使油脂游離出來[17]，因此首先采用纖維素酶對微藻進行酶解反應。采用纖維素酶對微藻酶解后所得到的油脂提取率見表2。

表1 索氏抽提法提取微藻油脂的含量

表2 纖維素酶對微藻酶解后的油脂提取率

從表2可以看出，與未加入纖維素酶的處理相比，加入纖維素酶后可以大幅提高兩種微藻的油脂提取率，這說明加入纖維素酶有利于微藻的破壁。以微擬球藻為例，對微藻酶解前后進行掃描電鏡（SEM）分析對照，酶解前后微擬球藻的SEM照片如圖1所示。

從微擬球藻酶解前后的SEM照片可以看出，加入纖維素酶對微擬球藻酶解后，在掃描電鏡視野中已基本沒有完整的微藻細胞存在，微藻細胞已完全破碎，這說明加入酶可以達到使微藻細胞壁破碎，這有助于微藻油脂的提取。

圖1 微擬球藻酶解前后SEM照片

2.3 酸堿預處理對微藻破壁油脂提取的影響

在微藻處理過程中，酸、堿既可以起到調節反應體系pH值的作用，同時又可以起到調節細胞壁內外化學環境、軟化或降解纖維素等效果，因此，采用酸、堿輔助水熱處理等手段對微藻溶液預處理是水酶法提取植物油脂常用的輔助手段[18-19]。加入酸或堿在80 ℃下對微藻預處理后8 h，再調節pH值至5.0后加入纖維素酶酶解微藻所得到的油脂提取率見表3。從表3可以看出，采用酸堿預處理兩種微藻后，油脂提取率均明顯提高，可見采用酸堿預處理方式是有效的。其中采用堿預處理兩種微藻油脂的提取率均明顯高于用酸預處理的，并也遠高于單獨使出堿預處理的，說明了堿預處理和纖維素酶酶解聯合應用可更有效地將兩種微藻油脂從細胞壁中游離出。在此后的微藻預處理過程中將采用堿預處理方式。

2.4 復合酶對微藻破壁油脂提取的影響

微藻的細胞壁成分除了纖維素、半纖維素，還含有果膠質、藻酸鹽、藻多糖、聚半乳糖和硫酸酯等。而油脂在藻細胞內部通常與其他大分子結合，構成脂多糖和脂蛋白等復合體，并且不同微藻的細胞壁結構也有所差異。因此，需要加入纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等組合，綜合考察不同酶組合對各種微藻的酶解效率。復合酶對兩種微藻油脂提取率的影響見表4。從表4可以看出，果膠酶、蛋白酶等可以輔助破碎微擬球藻細胞壁，復合酶的使用有助于提高微擬球藻油脂的提取率，當纖維素酶、蛋白酶和果膠酶同時使用時，其油脂提取率提高到69.76%。但對小球藻來說，復合酶的使用沒有促進該微藻的油脂提取，反而有所降低，說明小球藻的細胞壁結構與微擬球藻明顯不同，對生物酶的敏感性差異較大，三種生物酶的加入沒有產生協同作用，因此在后面的實驗中處理微擬球藻將采用纖維素酶、果膠酶和蛋白酶的組合，而小球藻只使用纖維素酶。

表3 預處理后纖維素酶酶解微藻的油脂提取率

表4 復合酶對微藻油脂收率的影響

2.5 萃取溶劑對微藻油脂提取的影響

在微藻油脂提取的過程中，可采用有機溶劑作為萃取溶劑將微藻細胞破壁后析出的油溶性物質萃取出來。考慮到有機溶劑與水相的互溶性較差，不利于微藻油脂的析出和萃取，因此在萃取過程中加入第二極性溶劑，提高有機溶劑與水相的有效接觸，從而提高微藻油脂的析出。不同有機溶劑以及有機溶劑和極性溶劑組合成雙溶劑體系對微藻油脂提取率的影響見表5。從表5可以看出，加入極性溶劑甲醇或乙醇后，明顯提高了兩種微藻油脂的提取率，表明雙溶劑體系可以協同作用，有效提取微藻中的極性及非極性油脂組份，特別是加入甲醇后，微藻油脂提取率明顯提高，這是因為甲醇對于微藻的滲透性更強，更有利于微藻油脂的析出。

2.6 微藻油脂的可皂化物及不可皂化物含量的測定

微藻細胞破壁后提取油脂時，采用不同有機溶劑所得到的微藻油脂的性質也有一定差異。按照生物柴油可皂化物的測定方法可以測定所得油脂中可皂化物及不可皂化物的含量，表6中列出了分別采用正己烷-乙醇或三氯甲烷-乙醇體系萃取得到的兩種微藻油脂中可皂化物及不可皂化物的含量。從表6可以看出，采用正己烷-乙醇體系萃取的微藻油脂中可皂化物含量要較三氯甲烷-乙醇體系萃取的高，這也表明采用正己烷-乙醇雙溶劑體系萃取油脂有利于得到可皂化物含量更高的微藻油脂，有利于進一步合成以微藻油脂為原料的微藻生物柴油。

表5 萃取溶劑對提取微藻油脂的影響

表6 不同溶劑萃取的微藻油脂中皂化物含量

2.7 微藻油脂中脂肪酸的成分分析

微藻油脂不易被汽化，特別是所提取的微藻油脂中含有甾醇、色素以及三甘油酯等成分，因此要對微藻油脂中的多不飽和脂肪酸進行分析比較困難，通常要把所提取的微藻油脂皂化、甲酯化后再進行氣相色譜分析[21]。將得到的微藻油脂分離可皂化物甲酯化后得到的脂肪酸分析結果見表7。

從表7可以看出，所提取的微藻油脂包含的脂肪酸種類較多，其主要成分是棕櫚酸（C16：0）、棕櫚油酸（C16：1）、十八碳烯酸（C18：1）、二十碳五烯酸（C20：5）及亞油酸（C18：2）等，特別是C20以上的長鏈脂肪酸，如：花生四烯酸ARA（C20：4）含量達2.8%以上，二十碳五烯酸EPA（C20：5）含量超過10%，這些物質是普通動植物油脂所不能提供的，對人體有益的脂肪酸成分，因此，微藻養殖產業對于人類營養供應乃至CO2減排都是一項前景廣寬的產業。

3 結論

綜合以上結果可知，堿法預處理和水酶法聯合應用對于微擬球藻和小球藻細胞破壁提高油脂提取率具有顯著的協同效應。采用正己烷-乙醇作為萃取溶劑替代傳統使用的三氯甲烷為基礎萃取溶劑，對于兩種微藻油脂的提取仍然具有較好的效果，并可以萃取更多的可皂化物，有利于后續生物柴油的加工。在較低的溫度下（低于100 ℃），微擬球藻的油脂提取率可達90%以上，而更難破碎的小球藻油脂也可達50%以上，實現了兩種微藻的高效節能提取。對微藻油脂中多不飽和脂肪酸的分析結果表明，小球藻、微擬球藻的藻油中含有豐富的C20以上的長鏈脂肪酸，特別是EPA、ARA等組分含量較高，是對人體有益的營養成分，體現了微藻養殖產業的綠色、環保等社會效益和經濟效益。本研究中的相關方法和結果對促進微擬球藻和小球藻油脂提取的規模化應用，具有一定的借鑒意義。

表7 微藻油脂中的脂肪酸組成（w）/%