錐栗嫁接苗與實生苗葉片解剖特征及光合特性比較

李艷麗，熊 歡，彭小博，鄒 鋒，袁德義

(中南林業科技大學, 經濟林培育與保護教育部重點實驗室, 經濟林育種與栽培國家林業局重點實驗室, 經濟林培育與利用湖南省2011協同創新中心, 湖南 長沙 410004)

【研究意義】錐栗(CastaneahenryiRehd.et Wils)屬殼斗科(Fagaceae)栗屬(Castanea)植物，是我國南方特有的木本糧食樹種，分布于秦嶺-淮河以南地區，其中在福建、浙江和湖南等山區資源分布最為集中[1]。我國現有錐栗的種植面積達100萬 hm2，年產值數十億元[2]。發展錐栗生產對于促進山區精準扶貧、建設美麗鄉村具有重要的意義。近年來，錐栗在我國南方丘陵山區開始大規模的人工種植。實生苗適應性廣、生長較快，由于遺傳變異較大，存在童期長、掛果遲的問題，直接限制了當前錐栗產業化發展的進程。然而嫁接苗不僅可以保持親本優良品種的性狀，提高錐栗苗木對環境的適應能力，還可以縮短童期、提早開花結果[3]。苗木的光合能力影響其生長和發育，而葉片是植物進行光合作用的主要器官[4]，特別是葉片內部各種組織的厚度和比例、葉肉細胞的大小和排列等結構特征會很大程度地影響葉片的光合功能[5]。【前人研究進展】目前，在植物葉片結構與光合特性的關系上已有一些研究報道。例如，黃娟等曾以楊樹(Populustremula)為試材，發現楊樹的葉肉組織厚度與其氣體交換能力存在相關關系[6]；梁文斌等曾以短梗大參(Macropanaxrosthornii)苗木為試材，發現葉綠素含量的增加有利于植物在低光強下更有效、更多地吸收光能[7]；祁傳磊等曾研究發現大青楊(PopulusussuriensisKom.)的葉片結構(葉面積、柵欄組織厚度及柵欄組織與海綿組織厚度的比值)與其光合能力的關系密切[8]。在錐栗的研究上，主要集中在良種選育[9]、高效栽培技術[10]以及加工利用[8]等方面。然而關于錐栗嫁接苗與實生苗在葉片生長狀況、形態結構及光合特性上的研究則報道較少?！颈狙芯壳腥朦c】因此，本文以2年生錐栗嫁接苗與實生苗為試材，對比分析葉片生長狀況、形態結構及光合特性的差異，探明嫁接苗與實生苗葉片的結構與光合利用的相關關系，為錐栗的良種苗木繁育提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗場所選在中南林業科技大學生命科學樓，位于112°59′32″ E，28°8′14″ N，海拔約100 m。試驗以2年生盆栽錐栗嫁接苗與實生苗為材料，其中嫁接苗砧木為‘華栗4號’，接穗品種為‘華栗4號’；實生苗采用‘華栗4號’種子實生播種，基質為黃心土∶泥炭∶珍珠巖=4∶2∶1。

1.2 測試項目及方法

1.2.1 葉片顯微結構和生長參數 2017年8月上旬，于晴天上午采集成熟錐栗葉片，采用無色透明的指甲油印跡法，進行氣孔密度測定[11]；采用30 % NaOH溶液浸泡和0.5 %甲苯胺藍染色法[12]， 進行葉脈密度測定；采用石蠟切片法[13]，運用OLYMPUS-BX53型顯微鏡進行葉片顯微結構觀察；選取苗木第2～4節完全開展的葉片20個，進行葉片生長指標測定，即面積、周長、葉長、葉寬、干重和比葉面積(即葉面積/葉片干重)等[14]。

1.2.2 葉綠素含量(Cc) 取新鮮葉片0.02 dm2放入試管中，加10 mL的丙酮乙醇(V∶V=1∶1)提取液，用UV-1100型分光光度計(上海，中國)進行光合色素：葉綠素a(Chlorophyll a，Chla)和葉綠素b(Chlorophyll b，Chlb)含量的測定[15-16]。

1.3 數據處理與分析

采用Excel2013和Origin8.5分別進行數據統計和繪制折線圖，運用SPSS19.0進行單因素方差、差異顯著性(P<0.05)及線性相關關系分析。

2 結果與分析

2.1 葉片生長參數

如表1所示，嫁接苗葉片的面積、周長、長度、寬度及干物質量均較實生苗高，而比葉面積則低于實生苗。嫁接苗葉面積44.23 cm2是實生苗(24.55 cm2)的1.80倍；嫁接苗葉片干質量0.29 g是實生苗(0.14 g)的2.07倍；然而實生苗比葉面積182.76 cm2·g-1是嫁接苗(152.10 cm2·g-1)的1.20倍。

表1 錐栗嫁接苗與實生苗葉片生長情況比較

注：表中數據為平均值±標準差；同列不同小寫字母表示P<0.05顯著差異，下同。

Note：Values are means±SE.Values within a column followed by the different normal letters are significantly different atP<0.05.The same as below.

2.2 葉片顯微結構特征

2.2.1 表皮細胞(EC) 比較錐栗苗木葉片的表皮細胞(表2和圖1 A～B)后可以看出，錐栗不同苗木的上下表皮厚度差異顯著(P<0.05)，嫁接苗的上/下表皮細胞厚度均較實生苗厚。嫁接苗上/下表皮細胞體積較大、排列疏松呈不規則形狀；而實生苗表皮細胞則排列緊密，形狀較為規則。

2.2.2 葉肉細胞(MC) 錐栗葉片屬于典型的異面葉，即柵欄組織細胞(Palisade cell)和海綿組織細胞(Spony mesophyll)分化明顯(圖1A～B)。一般而言，柵欄組織細胞呈柱狀水平排列，深2層；海綿組織形狀不規則，排列疏松。錐栗不同苗木的柵欄組織厚度和海綿組織厚度的差異顯著(P<0.05)(表2)。嫁接苗的柵欄組織和海綿組織形狀較實生苗不規則、排列較實生苗不夠緊密。嫁接苗的柵海比值1.39是實生苗(1.26)的1.10倍。

2.2.3 葉脈特征(VC) 錐栗葉片的維管束屬于外韌型，即主脈直徑較大，機械組織(Mechanical organization,Mo)較發達(圖1 C～D)。嫁接苗主脈厚度1168.43 μm是實生苗(848.43 μm)的1.38倍(表2)。嫁接苗與實生苗葉脈密度的差異顯著(P<0.05)，嫁接苗葉脈密度0.95 mm·mm-2>實生苗(0.72 mm·mm-2)(表2和圖1E～F)。

2.2.4 氣孔特征(SC) 錐栗葉片氣孔屬于典型的腎形氣孔，主要分布在葉片下表皮(圖1G～H)。錐栗不同苗木的氣孔密度差異顯著(P<0.05)，嫁接苗氣孔密度145.00 個·mm-2>實生苗73.00 個·mm-2。嫁接苗氣孔數目較多且分布密集；實生苗氣孔數目較少且分布稀疏。

2.3 葉片光合參數

2.3.1 光合-光響應曲線(Pn-PPFD) 由圖2和表3可知，2種苗木葉片的Pn-PPFD曲線走勢基本一致，曲線的形狀可隨PPFD狀況的改變發生變化。在弱光(PPFD<200 μmol·m-2·s-1)條件下，Pn呈直線上升，但差異較小；隨著光強的進一步增大(高于光補償點)，Pn的上升幅度逐漸減小，嫁接苗的Pn較實生苗高，且差異顯著(P<0.05)。2種苗木的Pmax、LCP、Rd及AQY差異顯著(P<0.05)(表3)，嫁接苗的LSP為680.60 μmol·m-2·s-1<實生苗(705.20 μmol·m-2·s-1)、Pmax為6.77 μmol·m-2·s-1是實生苗(5.13 μmol·m-2·s-1)的1.32倍、AQY為0.05較實生苗(0.04)高出18 %。

表2 錐栗嫁接苗與實生苗葉片顯微結構比較

A嫁接苗葉肉組織橫切面；B實生苗葉肉組織橫切面；C嫁接苗葉片主脈橫切面；D實生苗葉片主脈橫切面；E嫁接苗葉脈結構；F實生苗葉脈結構；G嫁接苗葉片下表皮氣孔；H實生苗葉片下表皮氣孔。 UE：上表皮； PT：柵欄組織；ST：海綿組織；LE：下表皮；LVB：側脈；MT：機械組織； Me：葉肉；X：木質部；Ph：韌皮部；GT：基本組織；V：葉脈；SA:氣孔器；EC：表皮細胞；Sto：氣孔；GC：保衛細胞；EP：表皮；EH：表皮毛。A～B, 標尺=100 μm；C～F, 標尺=200 μm；G～H, 標尺=50 μmA mesophyll cross section of grafts; B mesophyll cross section of seeds; C main vein cross section of grafts; D main vein cross section of seeds; E vein structure of grafts; F vein structure of seeds; G epidermal stomata of grafts; H epidermal stomata of seeds. UE, upper epidermis. PT: palisade tissue; ST: spongy tissue; LE, lower epidermis; LVB, lateral veins; MT, mechanical tissue; Me, mesophyll; X, xylem; Ph, phloem; GT: basic tissue; V: veins; SA: stomatal apparatus; EC: epidermal cells; Sto: stomata; GC: guard cells; EP: epidermis; EH: epidermal hair. A-B, Bar = 100 μm; C-F, Bar = 200 μm; G-H, Bar = 50 μm圖1 錐栗嫁接苗與實生苗葉片結構特征Fig.1 Leaf structure characteristics of grafts and seeds ofC.henryi

圖2 錐栗嫁接與實生苗的凈光合速率對不同光照強度的響應Fig.2 Response of net photosynthetic rate ofC.henryigrafts and seeds under different light intensities

2.3.2 光合參數 如表4所示，Pn、Gs及Ci呈顯著性差異(P<0.05)。嫁接苗Tr、Pn、Gs及WUE較實生苗高，而嫁接苗Ci為299.49 μmol·mol-1則較實生苗(359.68 μmol·mol-1)低。2種苗木的葉綠素含量Cc呈顯著差異(P<0.05)，嫁接苗Cc：4.35 mg·dm-2>實生苗2.43 mg·dm-2。

2.4 葉片結構與光合特性的相關關系

由表5可知，2種苗木葉片的葉綠素含量(Cc)、柵欄組織厚度(FTT)、海綿組織厚度(STT)、上表皮細胞厚度(UECT)、葉面積(LA)以及氣孔密度(SD)與凈光合速率(Pn)呈極顯著的正相關；葉片干物質量(LDMQ)與凈光合速率(Pn)的正相關關系則不顯著。兩種苗木葉片的比葉面積(SLA)與Pn的負相關關系則未達到顯著水平。2種苗木葉片的SD與氣孔導度(Gs)呈極顯著的正相關關系。

3 討 論

光合-光響應曲線(Pn-PPFD)揭示了葉片的光合特性[19]。光補償點LCP和光飽和點LSP分別表示植物利用弱光和強光的能力[1]。與實生苗相比，嫁接苗的LCP低和LSP高，說明了嫁接苗對弱光和強光環境的適應能力強于實生苗。Pmax表示了植物的潛在最大凈光合效率，即光飽和點(LSP)時的光合速率[20-21]。本研究測得的嫁接苗Pmax值高于實生苗，且差異顯著(P<0.05)，表明了在相同的生長環境下，嫁接苗的光合能力較強。一般情況下，植物的光合能力與暗呼吸速率Rd呈正相關性，即LSP越高、Rd越大[22]。本文中，錐栗嫁接苗的LSP和Rd值都高于實生苗，這也表明了嫁接苗具有較強的光合能力。

表3 錐栗嫁接苗與實生苗的凈光合速率對光合有效輻射響應的特征參數

Table 3 The characteristic parameters of the net photosynthetic rate of grafts and seeds ofC.henryion the photosynthetic active radiation response

最大凈光合速率(μmol·m-2·s-1)Maximum netphotosynthetic rate光補償點(μmol·m-2·s-1)Light compensationpoint光飽和點(μmol·m-2·s-1)Light saturationpoint表觀量子效率Apparent quantum yield暗呼吸速率(μmol·m-2·s-1)Dark respiration嫁接苗Grafts6.77±0.02a17.79±0.08a705.20±6.240.05±0.00a1.02±0.01a 實生苗Seeds5.13±0.00b25.20±0.01b 680.60±4.360.04±0.00b0.83±0.00b

表4 錐栗嫁接苗與實生苗葉片光合參數的差異

表5 錐栗嫁接苗與實生苗葉片結構與光合特性的線性相關關系

植物葉片的光合速率是通過測定凈CO2吸收得到的，而光合細胞內真正的CO2供應效率是受葉片表皮氣孔細胞的控制[5]。比較錐栗不同苗木下表皮氣孔的差異后發現，嫁接苗氣孔的單位面積數目較多，同時期的開放程度較大，且分布密集。在光合指標(Pn、Ci和Gs)的方面，嫁接苗的Pn和Gs值高于實生苗，Ci較實生苗低，其中氣孔導度Gs(即氣孔開放程度)的大小變動直接影響光合作用所需底物CO2的供應，從而影響葉片的光合速率[5]。這表明嫁接苗較高的氣孔密度、Gs及較低的比葉面積(即CO2進入細胞壁的阻力小)有益于光合作用底物CO2順利地進入葉片，因而增強葉片的Pn。

葉片的解剖結構高度特化，以便更好地吸收陽光[23]。葉片表皮層細胞對可見光是完全透明的，單個細胞常呈平凸狀起到聚光作用，聚集進入光合細胞的光線，因而使到達葉綠體的PPFD提高到周邊光量的數倍之多[24]。本文中，嫁接苗的表皮層細胞較實生苗具有凹面突出、體積大、形狀不規則及排列疏松的特征，更利于外界光線較多地聚集進入葉片內部，且對適應不同強度的光照也有較好的調節功能。植物的柵欄層細胞就像導光管，最外層葉綠素含量非常高，能夠增加直射光的透射深度[24]，而葉綠素是光合生物中的典型色素，具有吸收光以驅動光合作用的功能[25]。研究顯示，錐栗苗木的柵欄組織呈柱狀平行排列、深2層，其中嫁接苗的柵欄組織厚度顯著高于實生苗。在葉綠素含量Cc的測定上，錐栗不同苗木Cc的差異顯著(P<0.05)，且與Pn之間呈極顯著的正相關(P<0.01)。這表明，在嫁接苗柵欄組織中，葉綠體的分布數目可能多于實生苗，并在光合作用過程中吸收較多的光量，從而增強柵欄組織細胞的的光合效率。錐栗不同苗木的海綿組織細胞形狀不規則，并被空氣泡包圍著，由空氣泡所組成的氣體空間為散射光線提供了大量的氣-水界面。因此，光在細胞和氣體的界面上可進行多次反射，從而很大程度上延長了光的傳遞路徑，也因而增加了光能被吸收的可能性[26]。研究顯示，與實生苗相比，嫁接苗的海綿組織細胞排列較疏松、包圍在外的空氣泡較大，因而氣-水界面也較多。由此發現，嫁接苗的 柵欄組織結構特性利于光順利進入葉片;海綿組織結構特性益于光的散射和反射，由此較實生苗就能更均衡地吸收和利用光，從而更好地進行光合作用。一般來講，葉片主脈的厚度越大[27]、葉脈的密度越大，葉片內部的水分運送效率也越高。本文中，錐栗不同苗木葉片的主脈厚度、葉脈密度與水分利用效率WUE的相關性顯著(P<0.05)，且嫁接苗的主脈厚度、葉脈密度和WUE都高于實生苗，這表明了嫁接苗葉片較高的水分利用水平、合成的有機物運轉能力與其葉片結構特征關系密切。

4 結 論

本文研究表明，2年生錐栗苗木葉片整體(氣孔、光合機構和葉脈疏導組織等)相互協調響應對葉片的光合作用產生一定影響；嫁接苗與實生苗在葉片生長狀況、葉片解剖結構及光合特性方面呈顯著差異(P<0.05)，嫁接苗對光的適應性和光能利用能力強于實生苗。