實時熒光定量PCR儀用于流感病毒檢測的效果分析

張群 劉超 李蕾

【摘 要】 目的：采用實時熒光定量PCR儀檢測流感樣病例標(biāo)本中的流感病毒，分析其檢測效果。方法：在2018年1月至2018年12月實驗室所收集的120例流感樣病例患者作為本次研究對象，分別采取流感病毒細(xì)胞分離檢測法和實時熒光定量PCR檢測法，分析其檢測結(jié)果。結(jié)果：實時熒光定量PCR法檢測陽性率明顯高于流感病毒細(xì)胞分離檢測法，P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：對流感病毒進(jìn)行檢測時可以優(yōu)先考慮選擇實時熒光定量PCR法，其檢出陽性率更高，值得進(jìn)行推廣應(yīng)用。

【關(guān)鍵詞】 實時熒光定量PCR儀;細(xì)胞培養(yǎng);流感病毒檢測

【中圖分類號】R715【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】B【文章編號】1005-0019（2019）09-197-01

流感病毒也可以稱為流行性感染，其癥狀和普通感冒沒有明顯差別，很容易混淆。實驗室中對流感病毒進(jìn)行檢測的傳統(tǒng)方法用時比較長，而且其技術(shù)要求比較高，無法及時診斷出暴發(fā)疫情。而實時熒光定量PCR技術(shù)主要是通過PCR針對核酸進(jìn)行擴(kuò)增[1]，其探針技術(shù)具有較高的特異性，采取定時定量檢測的方法，相比于常規(guī)性的PCR檢測，其特異性更強(qiáng)、靈敏度更高，具有更高的應(yīng)用價值。本文針對實驗室流感病毒樣本采取實時熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行檢測，具體內(nèi)容如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

在2018年1月至2018年12月實驗室所收集的120例流感樣病例患者作為本次研究對象，患者均對研究知情并同意提供樣本參與本次研究，樣本為所有研究對象的咽拭子標(biāo)本，研究對象復(fù)核流感樣病例的定義，身體溫度都在38℃以上，存在咳嗽、咽痛等臨床癥狀。采集得到的標(biāo)本將其存放在3ml的病毒采樣管中，在24小時內(nèi)送到實驗室進(jìn)行檢測，樣本留置時間不能過長。

1.2 方法

細(xì)胞分離檢測法具體操作：對標(biāo)本應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)法進(jìn)行分離、接種，再根據(jù)類型分類，每瓶25ml的比例對每份標(biāo)本進(jìn)行接種，每份標(biāo)本接種2瓶，從第2天觀察標(biāo)本是否存在細(xì)胞病變，當(dāng)75%-100%細(xì)胞出現(xiàn)病變時進(jìn)行收獲，即使無細(xì)胞病變也應(yīng)該于第7天收獲。再用豚鼠血展開血凝試驗，觀察血凝度及其滴度，當(dāng)血凝滴度取得數(shù)值小于1：8或者是陰性培養(yǎng)物在傳到第2代依然為陰性則可以將這些標(biāo)本拋棄。結(jié)合國家流感中心標(biāo)準(zhǔn)參照血清，實施HAI試驗，將流感病毒進(jìn)行分型。

實時熒光定量PCR儀檢測具體操作：所有樣本都需要進(jìn)行病毒檢測，按照試劑盒說明提取RNA及配置反應(yīng)體系，實時熒光PCR系統(tǒng)操作時應(yīng)用SDS軟件，設(shè)置有陽性以及陰性的對照，其反應(yīng)流程包括以下：30min設(shè)定為50℃、3min設(shè)定為95℃、15s設(shè)定為95℃、30min設(shè)定為50℃、1min設(shè)定為72℃這五個循環(huán);10s設(shè)定95℃、40s設(shè)定55℃為40個循環(huán)。其中將FAM設(shè)定為熒光素，當(dāng)在55℃時進(jìn)行熒光信號的收集。

2 結(jié)果

這些樣本中經(jīng)病理診斷：新甲型H1N1流感病毒72份，季節(jié)性H3亞型病毒23份，乙型病毒15份。細(xì)胞分離檢測法：檢測出新甲型H1N1病毒65份，占比54.2%，季節(jié)性H3亞型病毒20份，占比16.7%，乙型病毒有15份，占比12.5%，未能明確的流感病毒15份，占比12.5%。陽性檢出率為87.5%。實時熒光定量PCR法檢測：檢測出新甲型H1N1流感病毒74份，占比61.7%，季節(jié)性H3亞型流感病毒22份，占比18.3%，乙型流感病毒20份，占比16.7%，未能明確的病毒4份，占比3.3%。檢出陽性率為96.7%。實時熒光定量PCR檢出陽性率高于細(xì)胞分離檢測法，差異顯著，x2=12.012，p<0.05。

3 討論

流感屬于一類急性呼吸系統(tǒng)病癥，其引起物質(zhì)為病毒感染，患者患病大都會表現(xiàn)為高熱、咳嗽等癥狀，流感病毒引起的疾病特點在于具有很強(qiáng)的傳染性，很容易引發(fā)大規(guī)模的暴發(fā)流行疾病，而且潛伏期比較短，對公眾健康造成極大的威脅。主要的流感類型包括甲、乙、丙三種，其中甲型流感比較常見。對人體健康造成的威脅最大，需要采取有效、及時的檢測和控制措施。流感病毒具有很強(qiáng)的

課題名稱：淄博市科學(xué)技術(shù)發(fā)展計劃政策引導(dǎo)類，項目編號：（2015kj010040）

淄博市環(huán)境有機(jī)污染與人群健康監(jiān)測分析重點實驗室

致病能力，而且在傳播的過程當(dāng)中很容易發(fā)生變異，人們對于具有特異性的菌株沒有必要的免疫力，很容易引起大范圍的流感[2]。

在實驗室中對流感病毒進(jìn)行診斷最常用的方式通常是分離病毒和鑒定病毒。采取細(xì)胞培養(yǎng)法可以對流感病毒進(jìn)行分離，從而保證流感病毒的抗原性以及原始標(biāo)本處于一致的狀態(tài)下，有利于進(jìn)行長時間的儲存，能夠?qū)Σ《究乖砸约盎蜻M(jìn)行更好地分析。但是細(xì)胞培養(yǎng)法存在一些缺陷，主要是其所分離得出的病毒無法進(jìn)行疫苗生產(chǎn)，并且進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)法檢測時其檢出率很容易被病毒載量被檢樣品的質(zhì)量所影響，當(dāng)被檢測的樣品質(zhì)量不夠高或者是病毒載量不足時，很容易出現(xiàn)假陰性的情況。同時，在對活體病毒進(jìn)行檢測時細(xì)胞培養(yǎng)法比較適用，因此采取該檢測方法需要在收集、保存標(biāo)本的過程中確保病毒的活性。實時熒光定量PCR是從傳統(tǒng)PCR技術(shù)上不斷進(jìn)行發(fā)展得到的，屬于一類新技術(shù)[3]，可以對核酸拷貝數(shù)量進(jìn)行實時監(jiān)測，具有很高的靈敏度，檢測速度也比較快，檢測過程中不容易受到污染，目前在病毒性病原體的檢測中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。聚聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）可以對特定的核苷酸片的指數(shù)級進(jìn)行擴(kuò)增，當(dāng)造成擴(kuò)增反應(yīng)后，對擴(kuò)增物進(jìn)行凝膠電泳定性分析，其中可以通過放射核素實施標(biāo)記后光密度掃描，采取定量分析措施。實時定量PCR主要是對PCR擴(kuò)增反應(yīng)當(dāng)中的每一個循環(huán)產(chǎn)物的熒光信號進(jìn)行實時檢測，在該過程中，定量以及定性分析起始模板到最后一個信號的收集，實時熒光定量PCR反應(yīng)產(chǎn)物都會不斷增多，熒光信號強(qiáng)度也會不斷增強(qiáng)，每經(jīng)過一個循環(huán)，就會收集到一個熒光信號強(qiáng)度，從中可以根據(jù)熒光強(qiáng)度的變化來觀察產(chǎn)物量的變化狀況，可以得到熒光擴(kuò)增曲線圖[4]。提取病毒RNA時采用實時定量PCR檢測法用時大都在3小時左右，針對于流感病毒具有較高的特異性，可以對多株多壓型的流感病毒進(jìn)行識別，相對于血清診斷、特異性抗體檢測等，該方法的特異性、靈敏性都比較高，有助于促使該類患者盡快得到確診[5-6]。

本研究對實驗室樣本采取實際分析，應(yīng)用實施熒光定量PCR技術(shù)對流感病毒核酸實施檢測，結(jié)果顯示，相比于細(xì)胞培養(yǎng)法檢測，實時熒光定量PCR檢測的檢出率更好，可以對流感病毒進(jìn)行準(zhǔn)確、迅速地檢測，但該方法在實施時需要具有較高條件的實驗室，實驗室需要有配備的特殊儀器以及操作人員也需要具備有較高的專業(yè)水平，樣本留置時間不宜過長，在檢測時要保證每一個環(huán)節(jié)都在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，而且還需要配合規(guī)范的儀器設(shè)備，才能得到準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，為流感的控制提供可靠依據(jù)，否則難以實現(xiàn)有效檢測。

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