胃蛋白酶結合柱后在線還原法分析重組人粒細胞刺激因子的二硫鍵

劉海龍 任偉成 宗利 王英武

摘 要 建立了一種利用胃蛋白酶在酸性條件下酶切，結合柱后在線還原法和液相色譜-質譜聯用系統分析蛋白質二硫鍵的方法。在酸性體系中，采用胃蛋白酶水解蛋白質，能夠最大限度地維持蛋白質二硫鍵的原有構象; 柱后在線還原法的應用能夠彌補胃蛋白酶酶切位點專一性差、數據解析困難等不足。本研究將二者相結合并成功用于分析重組人粒細胞刺激因子（rhG-CSF）的二硫鍵和未配對半胱氨酸。實驗結果表明，采用本方法測得經N-乙酰馬來酰亞胺烷基化處理的rhG-CSF中二硫鍵配對方式為Cys36-Cys42和Cys64-Cys74，Cys17全部被烷基化試劑結合，且未檢測到二硫鍵錯配，實現了二硫鍵的完全定位。不經過烷基化處理，采用本方法測得rhG-CSF中Cys36-Cys42、Cys64-Cys74和Cys17的錯配比例分別為9.1%、0%和12.6%; 基于胰凝乳蛋白酶的常規方法檢測到的二硫鍵錯配比例依次為73.4%、58.1%和97.5%; 采用Glu-C和胰蛋白酶聯合酶解的常規方法檢測到的錯配比例依次為40.3%、5.2%和22.3%。與常規方法相比，本方法檢測到的二硫鍵錯配比例更低，測定結果能夠更準確地反映二硫鍵在蛋白分子內的實際存在狀態。

關鍵詞 胃蛋白酶; 二硫鍵; 柱后在線還原法; 液相色譜-質譜聯用系統; 重組人粒細胞刺激因子

1 引 言

二硫鍵是一種常見的蛋白質翻譯后修飾類型，在穩定蛋白質的空間結構[1，2]、維持構象及發揮生物活性等方面有著非常重要的作用[3～7]。在蛋白質藥物中，二硫鍵構型也是一個非常關鍵的質量屬性[8]。二硫鍵構型分析，有利于深入地了解蛋白質的內部結構[9，10]，對蛋白質藥物的研發和質量控制具有重要意義。目前，準確分析蛋白質的二硫鍵組成仍是一個較大的挑戰[11～13]，這是由于蛋白質的結構較為復雜，隨著蛋白質分子內含有半胱氨酸數目的增多，其可能存在的二硫鍵配對方式呈指數級增長，解析難度也相應增加。此外，二硫鍵錯配現象的存在也會影響二硫鍵分析[14]。二硫鍵錯配可能導致蛋白質錯誤折疊、聚合和失活[15～17]，二硫鍵錯配可能源自蛋白質本身，也可能源自樣品處理或數據采集等過程。因此，為了得到準確的二硫鍵構型及控制蛋白藥物的二硫鍵錯配比例，盡可能降低樣品處理和檢測過程中的二硫鍵錯配是至關重要的。

近年來，在二硫鍵定位研究中常采用如下策略： 首先選擇合適的蛋白水解酶水解蛋白質，再取出一部分酶解液做還原處理，最后將還原前和還原后的酶解液分別采用液相色譜-質譜聯用系統（LC-MS/MS）進行檢測，通過對比還原前后的肽圖找到差異肽段，確定蛋白質二硫鍵的連接方式[18～20]。研究表明，酶的選擇和酶解體系都會影響二硫鍵錯配，當其它條件一定時，酶解液pH值越低，二硫鍵錯配程度越低[21]; 常見的蛋白水解酶（如胰蛋白酶、Lys-C酶和胰凝乳蛋白酶）的最適pH值一般為7～9，弱堿性環境將促進二硫鍵的重排[22]，當pH≤6時，酶活性下降，不能對蛋白進行充分酶解; 嗜熱菌蛋白酶（Thermolysin）能夠在弱酸性條件下水解蛋白質，但較容易引起二硫鍵錯配; Glu-C酶的水解位點一般僅限于天冬氨酸和谷氨酸殘基，在水解分子量較大的蛋白質時，具有一定的局限性。蛋白質分子內如存在未配對半胱氨酸，也可引起二硫鍵錯配[23]。對于此類蛋白質，通常需要先對半胱氨酸進行烷基化處理之后再進行酶解，如果未配對半胱氨酸被包裹于分子內部，烷基化過程將難以順利進行。因此，開發一種能夠減少二硫鍵錯配的分析方法，對蛋白質的二硫鍵研究具有重要意義。

胃蛋白酶是存在于哺乳動物胃液中的一種消化性蛋白酶，在pH 1～5范圍內能發揮較高的活力。胃蛋白酶常見的酶解位點一般為F、L、W、Y、A、E、Q、S 和 T[24]，由于胃蛋白酶的作用位點較多，且對不同作用位點的酶切效率不同，導致酶解片段復雜程度較高，譜圖難以解析，從而限制了其在蛋白質二硫鍵分析領域的應用[25]。柱后在線還原法是將還原劑以流動注射的方式與色譜流出端混合，并注入質譜儀進行檢測的一種方法[26～28]。借助于該方法，含有二硫鍵的肽段從色譜柱流出后、進入離子源之前被迅速還原，其還原產物的信號可直接被質譜儀捕獲，省去了對含二硫鍵肽段（簡稱二硫肽）的逐個收集、濃縮和還原等繁瑣步驟。在原理上，柱后在線還原法的應用可彌補胃蛋白酶的不足，在兼顧低豐度信號的同時，使肽質量圖譜的解析難度和實驗成本都大大降低。

分 析 化 學第47卷

第4期劉海龍等： 胃蛋白酶結合柱后在線還原法分析重組人粒細胞刺激因子的二硫鍵

重組人粒細胞刺激因子（rhG-CSF）是一種由174個氨基酸組成的蛋白質（其氨基酸序列見圖1），它包含兩對分子內二硫鍵和一個未配對半胱氨酸[29，30]。rhG-CSF分子內未配對半胱氨酸與分子穩定性密切相關[23]，也正是它的存在使得rhG-CSF產生二硫鍵錯配的風險大大增高。已有研究表明，在rhG-CSF中存在較高比例的二硫鍵錯配[14]，這可能對rhG-CSF藥物的安全性和有效性造成較大影響。因此，準確分析rhG-CSF的二硫鍵配對情況在藥品研發和質量控制中顯得尤為重要。本研究以rhG-CSF為研究對象，利用胃蛋白酶酶切結合柱后在線還原法和LC-MS/MS對其進行二硫鍵和未配對半胱氨酸的定位分析，并分別在經過NEM烷基化處理和不做烷基化處理的情況下，與基于胰凝乳蛋白酶、Glu-C酶+胰蛋白酶的常規分析方法進行對比，考察二硫鍵錯配情況，并探究在樣品處理過程中二硫鍵錯配的成因及避免（或降低）的方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Exion30AD型超高效液相色譜儀和Triple TOF 6600型高分辨質譜儀（美國AB SCIEX 公司）; 1 mL流動進樣針（瑞士Hamilton公司）。

rhG-CSF原液（純度>97%，濃度為11 mg/mL）來源于大腸桿菌發酵，采用KTAavant系統（美國GE公司）純化。NaOH（純度96%）、檸檬酸（純度99.5%）和HCl（36%～38%，w/V）購自北京化工廠; 二硫蘇糖醇（DTT，美國Promega公司）; N-乙基馬來酰亞胺（NEM）、乙腈（質譜級）和鹽酸胍（6 mol/L溶液）購自美國ThermoFisher公司; 胃蛋白酶（Pepsin）、三羥甲基氨基甲烷（Tris，純度>99%）、三（2-羧乙基）膦（TCEP，純度≥98%）和氨水（質量分數28%）購自Sigma-Aldrich公司; 胰蛋白酶（Trypsin）、Glu-C蛋白內切酶和胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）均為測序級，購自瑞士羅氏公司; 三氟乙酸（質譜級）購自日本和光純藥工業株式會社; 超濾離心管（MWCO 3 kDa）購自德國賽多利斯公司。實驗用水為超純水，采用Milli-Q純水系統（德國默克公司）制備。

2.2 實驗方法

2.2.1 rhG-CSF的烷基化 使用超濾離心管（MWCO 3 kDa）將rhG-CSF溶液置換為含3 mol/L鹽酸胍的50 mmol/L檸檬酸緩沖液（pH=5.0），將rhG-CSF終濃度控制為1 mg/mL。按體積比50∶1（蛋白∶NEM溶液）加入0.1 mol/L NEM溶液，25℃孵育4 h。

2.2.2 rhG-CSF的胃蛋白酶酶解 將經過NEM烷基化處理和未經烷基化處理的rhG-CSF樣品使用0.1 mol/L檸檬酸緩沖液（以NaOH調至pH=3.0）進行緩沖液置換，并將蛋白終濃度控制為1 mg/mL。按照質量比40：1（蛋白：酶）加入胃蛋白酶，混勻后置于37℃水浴中孵育16 h，取出后置于4℃終止反應。將酶解液取出一部分進行還原處理，以1 mol/L TCEP為還原劑，按照體積比100∶1（酶解液∶還原劑）將還原劑加入酶解液中，混勻后，室溫孵育30 min。

2.2.3 rhG-CSF的常規酶解 將經過NEM烷基化處理和未經烷基化處理的rhG-CSF樣品使用0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）進行緩沖液置換，并將蛋白終濃度控制為1 mg/mL，等量分裝。分別向兩支烷基化處理的rhG-CSF中加入胰凝乳蛋白酶和Glu-C酶，蛋白質和酶的質量比為40∶1。將上述混合液置于37℃水浴中孵育16 h，取出后置于4℃終止反應; Glu-C酶酶解樣品按質量比40∶1（蛋白∶酶）補加胰蛋白酶，37℃繼續孵育16 h后取出，置于4℃終止反應。未經烷基化的rhG-CSF酶解樣品按照上述步驟同步處理。各酶解樣品均取出一部分進行還原處理： 使用1 mol/L DTT作為還原劑，按體積比100∶1（酶解液∶還原劑）加入酶解液中，混勻后室溫孵育30 min。

2.3 液相色譜與質譜測定參數

2.3.1 LC-MS/MS檢測

將還原處理的酶解液和未經還原處理的酶解液均采用LC-MS/MS進行檢測。選用Waters peptide BEH C18 色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國Waters公司）進行色譜分離，柱溫為50℃，進樣體積30 μL，流動相A為0.05% TFA-超純水，流動相B為0.05% TFA-乙腈，流速0.2 mL/min。梯度洗脫程序： 0～80 min，0～37% B; 80～90 min，37%～46.5% B; 90～95 min，90% B。質譜儀在正離子模式下運行，一級質譜和二級質譜采集范圍分別為m/z 300～2000和m/z 50～2200。 GS1和GS2均設定為50，CUR為35，離子源溫度550℃，噴霧電壓5500 V。

2.3.2 柱后在線還原法結合LC-MS/MS檢測 rhG-CSF的酶解產物須另采用柱后在線還原法結合LC-MS/MS進行檢測。在線還原劑為含有0.2 mol/L DTT的9%氨水溶液，流速5 μL/min。柱后在線還原裝置的構建方法如下： 將流動注射針、液相色譜紫外檢測器的流出端和離子源以三通相連（圖2），離子源和三通之間的流路體積控制在25～50 μL之間，目的是在減少色譜峰的擴散作用同時保證還原反應的順利進行。其它色譜和質譜條件同2.3.1節。

2.4 LC-MS/MS數據分析

rhG-CSF的胃蛋白酶酶解樣品經LC-MS/MS 采集所得原始數據文件（. wiff 和. wiff. scan文件）后，采用PEAKS軟件（版本號8.5，美國ThermoFisher公司）進行肽段分析，根據圖1在軟件中輸入rhG-CSF的氨基酸序列，選擇搜庫模式并設置參數為胃蛋白酶酶切、分子量誤差20 ppm、Spider檢索。rhG-CSF的胰凝乳蛋白酶酶切和 Glu-C+胰蛋白酶酶切所得原始數據分別采用BioPharmaView軟件（版本號2.0，美國AB Sciex公司）進行數據分析，輸入rhG-CSF的氨基酸序列和所有可能形成的二硫鍵配對方式（包括自身錯配），選擇Peptide Mapping模式，并在“Digest Agent”選項中選擇對應的酶，最多漏切位點數目設為4個。

3 結果與討論

3.1? rhG-CSF的二硫鍵定位和未配對半胱氨酸分析

由于胃蛋白酶的酶切位點較多，且表現在各個酶切位點的活力各不相同，導致經常有不完全酶解的情況出現，使酶切肽圖過于復雜而難以解析。應用柱后在線還原法，可在一次進樣中采集到所有二硫肽還原產物的信號，將其與不采用柱后在線還原法所獲得的質譜數據進行對比，在每個二硫肽所對應的保留時間處找到其還原產物，采用數據分析軟件對還原產物的一級、二級質譜進行解析，推測出蛋白質二硫鍵連接方式。

經NEM烷基化處理的rhG-CSF胃蛋白酶酶解肽圖中，有8個色譜峰在還原后發生變化，色譜峰的保留時間分別為30.8、35.3、40.1、67.9、70.7、72.1、73.8 和75.8 min，依次命名Peak 1～Peak 8（圖3）。

未還原的rhG-CSF的胃蛋白酶酶解肽圖中，Peak 1～Peak 8對應肽段的分子量分別為1806.87、1788.85、1771.82、2831.45、2380.22、2616.36、2944.54和2550.32 Da。經柱后在線還原處理的質譜數據顯示： 保留時間為30.8 min的色譜峰1還原后產生分子量為690.36和1118.57 Da 的兩個肽段，分別對應氨基酸序號為32～37和38～46，其二級質譜信號與理論值匹配良好（圖4A和圖4B）。保留時間為35.3 min的色譜峰2還原后僅產生一個分子量為1790.86 Da的肽段，比原肽段增加2 Da。鑒定結果顯示此肽段的氨基酸序號為32～46，其二級質譜信號與理論值匹配良好（圖4C），該肽段包含2個半胱氨酸，它們互相結合形成二硫鍵。保留時間為40.1 min 的色譜峰3還原后產生一個分子量為1773.83 Da的肽段，分子量比35.3 min的色譜峰小17 Da，經鑒定該肽段氨基酸序號為32～46，第32位谷氨酰胺發生了焦谷氨酸化，其二級質譜信號與理論值匹配度較高（圖4D）。上述3個色譜峰所包含的二硫鍵均為Cys36-Cys42。

Peak 4～Peak 8經在線還原后分別產生分子量為2833.46、2382.24、2618.38、2946.56和2552.33 Da的肽段，PEAKS軟件鑒定結果顯示，上述肽段對應氨基酸序號分別為50～77、 56～78、 50～75、 50～78 和54～78，其二級質譜分別對應圖5A～5E。肽段的氨基酸序列和b/y離子匹配情況標記在相應的質譜圖中，5個肽段的二級碎片與各自理論值均匹配良好。由氨基酸序列可知，Peak 4～Peak 8所對應的5個肽段均含有Cys64和Cys74，且還原后肽段分子量均增加2 Da，因此可推斷Cys64和Cys74結合形成鏈內二硫鍵。

經過烷基化處理，rhG-CSF中未配對半胱氨酸的側鏈巰基與NEM結合。利用PEAKS軟件分析上述樣品的胃蛋白酶酶解肽圖數據，找到被NEM修飾的肽段，從而確定未配對半胱氨酸的位置。結果表明，保留時間為31.7和34.6 min的兩個色譜峰（分子量分別為857.46和729.40 Da）被鑒定為被NEM修飾的肽段，對應氨基酸序號分別為15～20和15～19，對應的二級質譜圖分別見圖6A和圖6B，二級碎片離子與理論值匹配良好（肽段氨基酸序列和b/y離子匹配情況均標注在圖中），這兩個肽段中被NEM修飾的位點均為第17位半胱氨酸。第19位谷氨酸存在不完全酶解現象，但不影響對結果的判定。根據上述結果可以確定，在rhG-CSF中第17位半胱氨酸為未配對半胱氨酸。

綜上可知，經烷基化處理的rhG-CSF二硫鍵配對方式為Cys36-Cys42、 Cys64-Cys74，Cys17與NEM結合，與文獻[14]報道一致。此外，在rhG-CSF分子中未發現天然的二硫鍵錯配信號。

3.2 rhG-CSF在不同酶和酶解條件下的二硫鍵錯配研究

在rhG-CSF的二硫鍵鑒定中，為了考察不同前處理條件（包括是否做烷基化處理、酶和酶切條件的選擇）對鑒定結果的影響，選擇胰凝乳蛋白酶和Glu-C酶+胰蛋白酶在pH 8.0的Tris-HCl體系下分別酶切，用LC-MS/MS對酶切產物進行檢測，借助BioPharmaView軟件進行數據分析。此外，利用胃蛋白酶

對于經過NEM烷基化處理的rhG-CSF，在pH 8.0的Tris-HCl緩沖液體系下用胰凝乳蛋白酶和用Glu-C+胰蛋白酶組合分別水解rhG-CSF，均檢測到了不同程度的二硫鍵錯配（表1），而在胃蛋白酶酶切樣品中則未檢測到二硫鍵錯配，說明當分子內不存在未配對半胱氨酸時，使用胃蛋白酶在pH 3.0緩沖液中酶解，能夠極大地抑制二硫鍵間的交換作用。而對比Glu-C+胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶酶切結果，未能檢測到Cys17的錯配， 說明烷基化反應較為徹底; Cys36-Cys42和Cys64-Cys74均檢測到一定比例的錯配，但均<3%，表明當溶液中不存在未配對半胱氨酸時，在pH 8.0 Tris-HCl 緩沖液中二硫鍵交換作用也會發生，但比較微弱。

對不經過烷基化處理的rhG-CSF，分析結果顯示其在3種酶切體系中均發生了一定程度的二硫鍵錯配（表1），其中胃蛋白酶酶切所得二硫鍵錯配比例最低，Glu-C+胰蛋白酶次之，胰凝乳蛋白酶酶切的錯配比例最高。主要的二硫肽及含有未配對半胱氨酸肽段的鑒定結果（包括錯配形式）見表2。

含有Cys17的肽段也能夠相互結合形成二硫鍵，這是一種“自身錯配”形式。由表1中括號部分可知，胃蛋白酶酶切所得自身錯配的比例為6.5%，遠低于胰凝乳蛋白酶和Glu-C+胰蛋白酶酶切所得的自身錯配比例（依次為24.1%和21.0%），上述差異可能與酶切體系的pH值有關，胃蛋白酶酶切的酸性體系能夠顯著抑制自身錯配的產生。

4 結 論

建立了一種基于胃蛋白酶和柱后在線還原法分析蛋白質二硫鍵的方法，并實現了rhG-CSF二硫鍵的定位分析。胃蛋白酶具有較多的酶切位點，且適用于酸性條件，能夠有效減少水解過程中產生的二硫鍵錯配; 采用柱后在線還原法，可省去對二硫肽的收集、濃縮和還原等步驟，能夠在二硫肽所對應的保留時間處直接獲得還原產物，且避免漏掉色譜保留能力較弱的還原產物; 二者結合使用，樣品處理過程中產生的二硫鍵錯配顯著減少，同時樣品處理和數據分析的工作量降低。通過與常規二硫鍵定位方法的對比發現，未配對半胱氨酸、酶解體系、含半胱氨酸酶切肽段的大小和構型等因素共同影響二硫鍵錯配的產生，而胃蛋白酶對rhG-CSF的酶切更傾向于產生含二硫鍵的環形肽段，降低被溶液中自由巰基攻擊的風險，從而更準確地反映二硫鍵在蛋白分子內的真實存在狀態。胃蛋白酶作為一種消化道蛋白酶，理論上適用范圍較廣，但仍需嘗試更多不同類型的蛋白質加以驗證。使用胃蛋白酶酶切結合柱后在線還原法分析蛋白質的二硫鍵，可為研究者提供新的方法和思路。

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