磁固相-內部萃取電噴霧電離質譜法快速測定人尿中的3-羥基苯并芘

劉建川 張華 黃海春 沈友起 王亞男 張小平

摘 要 將磁固相萃取（MSPE）和內部萃取電噴霧電離質譜（iEESI-MS）技術相結合， 建立了直接快速檢測人尿液中痕量PAHs代謝物3-羥基苯并芘（3-OHBaP）的方法， 并將此方法應用于吸煙人群與不吸煙人群尿樣中3-OHBaP的檢測。本研究以聚吡咯包覆的Fe3O4磁性納米顆粒材料作為MSPE的介質， 通過優化各項實驗參數（如固液比、毛細管電壓、洗脫液組成、洗脫體積等）， 將吸附了尿液中3-OHBaP的納米材料作為整體樣品直接進行iEESI-MS分析， 以m/z 239的信號強度為定量指標， 獲得最優實驗條件。結果表明， 尿樣基質中3-OHBaP在0.0005～2.500 μg/L濃度范圍內與m/z 239的信號強度的線性關系良好， 檢出限低至0.1 ng/L， 精密度（RSDs）小于8%， 整個樣品分析過程不超過4 min， 且吸煙志愿者尿液中3-OHBaP濃度明顯高于不吸煙志愿者。本方法操作簡單、快速、環境友好， 可為人群健康風險評價提供參考依據。

關鍵詞 磁固相萃取; 內部萃取電噴霧電離質譜; 多環芳烴; 3-羥基苯并芘; 健康風險評價

1 引 言

苯并芘即苯并[α]芘（BaP）， 由5個苯環組成， 其分布廣泛， 且結構穩定難以降解， 是首個被發現的環境化學致癌物[1]， 其致癌性最強， 分布最廣， 在食品、大氣、水體、土壤等中廣泛存在[2]。BaP可通過食物鏈的方式向人體轉移， 最終在人體內蓄積。有研究表明， BaP在體內經功能氧化酶（如CYP1A1）代謝活化后， 形成二氫二醇環氧化物、反式二羥環氧苯并芘等， 這些代謝物很容易與DNA結合形成加合物， 導致基因的突變和非正常表達[3]。該DNA加合產物已在吸煙者的肺中被發現， 可直接導誘導腫瘤的形成， 在肺癌患者中表現尤為明顯[4]。人通過空氣、水、食物等不同程度的暴露接觸BaP， 還容易誘發肺癌、皮膚癌、胃癌等多種疾病[5， 6]。此外， BaP的毒性具有長期和隱匿的特點， 在表現出癥狀前潛伏期可達25年左右[5]。因此， 建立快速、準確、高效地監測人體暴露BaP水平的檢測方法， 對保障人類健康以及環境治理等具有重要意義。

3-羥基苯并[a]芘（3-OHBaP）是BaP的代謝標志物[7]。 因此，可通過檢測人尿中BaP的代謝物（3-OHBaP）含量， 監測人體內BaP的暴露水平[7～10]。 目前， BaP代謝物檢測方法主要包括高效液相色譜-熒光檢測法（HPLC-FLD）[7]、氣相色譜-質譜法（GC-MS）[11]、高效液相色譜-串聯質譜法（HPLC-MS/MS）[9， 10]等。其中， HPLC-FLD方法操作繁瑣， 耗時費力， 且靈敏度較低。GC-MS和HPLC-MS/MS方法具有靈敏度高和準確等特點， 然而， 這些方法通常需要復雜的樣品預處理過程， 限制了對BaP的高通量分析， 不能滿足對人體BaP暴露量快速評價的需要。因此， 開發簡單、高選擇性、高通量的方法分析人尿中痕量3-OHBaP顯得尤為重要。人尿基質非常復雜， 且PAHs代謝物的含量極低。為進一步提高PAHs代謝物檢測的靈敏度， 一些研究者利用磁性材料微孔共聚物與PAHs之間的疏水作用和π-π堆疊作用， 對復雜基體中的痕量PAHs代謝物進行富集， 從而實現PAHs的高通量定性和定量分析[12～14]。本課題組前期發展了一種磁固相萃取-內部萃取電噴霧電離質譜（MSPE-iEESI-MS）的檢測方法， 首先是以聚吡咯包裹的Fe3O4作為磁固相萃取材料對尿液中的痕量1-羥基芘（1-OHP）進行選擇特異性吸附， 再采用iEESI-MS技術進行分析， 方法的檢出限低至0.1 ng/L[15]， 具有簡單、省時、 靈敏度高等特點。芘是PAHs中含量最豐富的組分之一， 因此， 在評價PAHs暴露水平時， 1-OHP（芘的主要代謝產物）被廣泛用作分析的目標物。但有研究者指出， 采用尿中1-OHP進行評價致癌PAHs的暴露程度不夠準確。 首先， 芘本身是一種非致癌物; 其次， 不同地理環境中PAHs特性不同， 各成分的含量不同， 如排放源不同， 芘與BaP或其它致癌PAHs的含量比例差異很大[16， 17]。因此， 研究者們開始采用一些其它致癌物的代謝產物作為標志物或同時采用多種代謝標志物進行評估， 如3-OHBaP、羥基菲等[18， 19]。其中， 尿液中的3-OHBaP受到特別關注， 它是致癌性BaP的主要單羥基代謝產物， 與1-OHP相比， 尿液中3-OHBaP更適合作為致癌性PAHs暴露的生物標志物[18]。然而， 在體內， BaP可被代謝轉化為酚類、二醇類、酮類或環氧類， 而這些代謝物主要隨糞便排出， 尿液中3-OHBaP的含量極低（pg/mL級別）， 比尿液中1-OHP的含量要低幾個數量級[16]。因此， 準確測定復雜尿液基質中低濃度的3-OHBaP難度較大。在前期研究基礎上， 本研究采用MSPE-iEESI-MS技術對人尿液樣品中的痕量3-OHBaP進行高效、高選擇性、高通量定量分析， 并將此方法應用于吸煙人群和不吸煙人群志愿者尿樣中3-OHBaP的快速檢測。通過對比分析不同人群尿樣中3-OHBaP的含量， 可監測人體內BaP暴露水平， 為人體健康風險評價提供參考依據。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

MSPE裝置和iEESI離子源均由本實驗室研制[15]; LTQ-XL線性離子阱質譜儀（美國Thermo公司）， 采用Xcalibur數據處理系統。3-OHBaP（GR級， 美國AuccStandard Inc公司）; 甲醇和乙酸（HLPC級， 美國ROE Scientfic公司）; 丙酮和苯（AR級， 國藥集團化學試劑有限公司）。

2.2 磁固相萃取材料（Fe3O4@Ppy）的制備

聚吡咯涂覆的Fe3O4磁鐵礦納米復合材料合成方法參照文獻[13， 20， 21]。首先采用溶劑熱法制得磁性Fe3O4納米球顆粒：稱取5.0 g FeCl3·6H2O， 溶于100 mL乙二醇中， 加入15.0 g醋酸鈉固體和50 mL乙二胺， 攪拌0.5 h， 將溶液轉移到反應釜中， 于200℃條件反應8 h， 再用乙醇/水清洗數次， 得到磁性顆粒， 于60℃真空烘干， 備用。

稱取磁性Fe3O4納米球顆粒1.0 g、 FeCl3·6H2O 9.1 g， 加入100 mL去離子水， 室溫下搖振3 h， 使Fe3+聚集在納米球表面， 加入20 mL十二烷基磺酸鈉和0.5 mL吡咯單體， 繼續搖振反應12 h， 再用乙醇/水清洗數次， 至上清液澄清， 于60℃真空烘干， 即得到聚吡咯包裹磁性Fe3O4復合材料。

2.3 尿液樣本的采集

尿液樣本由12名健康志愿者（7名不吸煙者和5名吸煙者）提供。收集每位志愿者晨尿于100 mL棕色玻璃瓶中， 在80℃保存， 實驗前將尿液室溫解凍。利用Fe3O4@Ppy材料對3-OHBaP的特異性吸附作用， 在尿液樣品中加入過量的Fe3O4@Ppy材料， 吸附去除可能存在的3-OHBaP， 再采用磁鐵將Fe3O4@Ppy材料吸附分離， 剩余的尿液樣本作為空白。取適量3-OHBaP標準品， 用甲醇配制成100 μg/mL的儲備液， 于4℃保存， 實驗時配制一系列濃度（0.0005～2.500 μg/L）的加標尿液樣本， 用于MSPE-iEESI-MS分析。

2.4 MSPE-iEESI-MS方法的建立

MSPE-iEESI-MS的工作流程參見本課題組前期工作[15]。原理為：依據Fe3O4@Ppy對3-OHBaP的特異性吸附作用， 將磁固相萃取介質Fe3O4@Ppy與iEESI-MS技術結合， 對人尿中痕量3-OHBaP進行吸附， 再將吸附了3-OHBaP的Fe3O4@Ppy作為整體樣品， 選取合適的萃取劑進行洗脫， 最后進入質譜分析。具體步驟如下：稱取0.1 mg Fe3O4@Ppy于15 mL玻璃瓶中， 依次分別加入2 mL甲醇和2 mL去離子水進行超聲活化30 s， 磁分離; 移取10 mL尿液樣品于上述玻璃瓶中， 渦旋1 min， 使Fe3O4@Ppy充分吸附尿樣中的痕量3-OHBaP， 再將混合物裝入2.5 mL進樣針中， 用磁鐵將材料吸附在注射器的內壁上， 將尿液排出。為了避免尿基質對3-OHBaP電噴霧溶液造成干擾， 用1 mL去離子水洗滌進樣針中的Fe3O4@Ppy兩次， 再加入萃取劑將Fe3O4@Ppy上的3-OHBaP進行洗脫， 輕輕搖晃使萃取劑與Fe3O4@Ppy充分混合， 使洗脫效果達到最佳。

3 結果與討論

3.1 人尿中3-OHBaP的MSPE-iEESI-MS快速定性分析

3.2 人尿中3-OHBaP的MSPE-iEESI-MS快速定量分析

向10 mL空白尿樣中加入一系列（0.0005～2.500 μg/L）的3-OHBaP標準溶液， 在最優的實驗條件下， 采用MSPE-iEESI-MS進行快速檢測分析， 每個濃度樣品重復測定6次， 繪制特征離子m/z 239信號強度的平均值與3-OHBaP對應濃度的關系曲線。 結果表明， 采用MSPE-iEESI-MS方法可以快速定量檢測人尿中痕量3-OHBaP， 在0.0005～2.50 μg/L濃度范圍內， 3-OHBaP的二級離子信號強度與其濃度具有良好的線性關系， 線性回歸方程為y = 5.063x + 1.555（R2 = 0.9989）（圖3）， 對3-OHBaP的檢出限為0.1 ng/L[23]， 相對標準偏差（RSD）低于8%。單個樣品分析時間小于4 min。上述結果表明， 對于含有ng/L級的3-OHBaP未稀釋的尿樣本， 可不經過復雜預處理， 直接采用MSPE-iEESI-MS進行檢測。這是因為磁性材料Fe3O4@Ppy對尿液中3-OHBaP的高效選擇性與特異性吸附， 以及MSPE-iEESI-MS特有的樣品加載過程， 有效避免了目標物的損失。采用MSPE技術可對大批量的尿液樣本進行快速處理， 進一步提高分析通量。

3.3 尿樣中3-OHBaP的快速測定

采用本方法對12名健康志愿者（其中5名吸煙者和7名不吸煙者）實際尿液樣本中的痕量3-OHBaP進行定量分析。實驗結果見表1， 在非吸煙者尿液中檢測到的3-OHBaP濃度為0.23～0.76 μg/L， 而經常吸煙者尿液中的3-OHBaP含量均大于1.48 μg/L。

4 結 論

采用MSPE-iEESI-MS技術， 對人尿樣中3-OHBaP進行了定性和定量分析。此方法操作簡單、省時、環境友好， 能夠區分吸煙者與不吸煙者人體內痕量3-OHBaP內部劑量的差異性， 可為人體內PAHs暴露的健康風險評估提供參考依據。本研究結果表明， 將常壓質譜技術與MSPE結合， 可為復雜基體生物和環境樣品中痕量待測物的高通量分析提供有效的策略。

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