調胃承氣湯灌胃與灌腸對腸源性膿毒癥大鼠腸上皮細胞occludin和ZO-1蛋白表達的影響

趙鋒利， 吳思慧， 趙馥， 羅苑苑， 徐運升， 冼紹祥

（廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東廣州 510405）

腸源性膿毒癥（gut-origin sepsis，GOS），是一種由腸道感染引發的全身性反應，主要包括引起宿主免疫功能失調，并最終導致多器官功能障礙（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）[1]。流行病學發現，全球每年患病人數超過數百萬，死亡率已超過患病人數的30%，并且這一數據仍在持續地擴大[2]。腸黏膜機械屏障破壞是誘發GOS的重要因素，細菌能夠通過受損的腸黏膜移位于其他器官組織，從而引起全身性炎癥，最終導致MODS[3]。 緊 密 連 接 蛋 白（tight junction protein，TJP）是腸黏膜機械屏障重要組成部分，已有大量文獻報導，多種腸道細菌感染性疾病與TJP的受損相關[4，5]。occludin和閉鎖小帶蛋白（ZO-1）作為腸上皮重要的TJP，能互相結合形成穩定的連接，對于維護腸黏膜屏障的完整性有非常重要的意義[6]。

調胃承氣湯對胃腸黏膜受損患者的療效十分顯著，且通過灌腸途徑給藥能顯著提高臨床療效[7，8]。本研究通過應用盲腸結扎穿孔法復制GOS大鼠模型，觀察和比較調胃承氣湯灌胃與灌腸2種療法對模型大鼠腸上皮細胞緊密結合蛋白occludin和ZO-1的影響，從而探討該方對GOS大鼠腸道屏障的作用機制及有效給藥途徑，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 48只SPF級雄性SD大鼠，體質量280～320 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（粵）2013-0002，實驗動物質量合格證號：44007200047550。動物實驗單位為廣東省中醫研究所SPF級動物實驗室，設施使用許可證號：SYXK（粵）2010-0059。

1.2 藥物與試劑 調胃承氣湯由大黃、芒硝、炙甘草組成。大黃（批號：130908261）、芒硝（批號：130707541）、炙甘草（批號：130713191）均購自康美藥業股份有限公司。大鼠降鈣素原（PCT）酶聯免疫吸附分析（ELISA）檢測試劑盒（批號：694180115）、大鼠D-乳酸（D-LA）ELISA檢測試劑盒（批號：254180115）均購自天津安諾瑞康生物技術有限公司；occludin抗體（批號：66378-1-Ig）、ZO-1抗體（批號：66452-1-Ig）均購自美國Proteintech公司。

1.3 儀器 Varioskan Flash型全波長多功能酶標儀（美國Thermo公司）；IQTM5型熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）；SmartSpec Plus核酸蛋白測定儀（美國Bio-Rad公司）；BS224S電子天平（1/萬）（德國SARTORIUS）；5450型小型高速離心機（德國Eppendorf公司）；JJ500型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；BSA2245型電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；IM5-50型全自動雪花制冰機（常熟市雪科電氣有限公司）；HH-6數顯恒溫水浴鍋（金壇市富華儀器有限公司）。

1.4 分組與給藥 將大鼠隨機分為6組，即假手術組，模型組，中藥灌胃高、低劑量組，中藥灌腸高、低劑量組，每組8只。中藥灌胃組以灌胃方式（10 mL/kg）給予調胃承氣湯，中藥灌腸組以灌腸方式（3 mL/kg）給予調胃承氣湯，正常組與模型組以灌胃方式給予等量生理鹽水。調胃承氣湯的臨床處方量為105 g（大黃60 g、芒硝15 g、炙甘草30 g），以此臨床用量為基礎，換算得出大鼠給藥劑量為9.450 g（生藥）/kg。在造模后2、10、24 h分別給藥，并在第3個時間點結束實驗。灌胃高、低劑量分別為9.450、4.725 g（生藥）/kg，按中藥湯劑換算灌胃量分別為3、1.5 mL（最終稀釋至3 mL）。灌腸高、低劑量分別為9.450、4.725 g（生藥）/kg，按中藥湯劑換算灌腸量分別為2.2、1.1 mL（最終稀釋至2.2 mL）。

1.5 模型復制 采用盲腸結扎穿刺法（CLP）復制GOS大鼠模型[9]。實驗前大鼠禁食12 h，使用100 g/L水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠。備皮后沿腹中線剪開約2 cm開口，小心取出盲腸置于提前消毒的紗布，用棉簽將糞便趕至盲腸尾端。用傳統代號為1號的醫用真絲編織線結扎盲腸50%，往盲腸尾端注射1 mL生理鹽水稀釋糞便后用10 mL注射器針頭穿孔3次，輕輕擠壓盲腸使糞便流出后將盲腸小心放回腹腔。逐層縫合切口，腹腔注射37℃5 mL生理鹽水使大鼠生理復蘇。

1.6 指標檢測與方法

1.6.1 蘇木素—伊紅（HE）染色觀察小腸組織病理變化 取各組大鼠的小腸組織，進行HE染色，在顯微鏡下進行病理學觀察。

1.6.2 ELISA檢測血清PCT和D-LA水平 嚴格按照PCT、D-LA ELISA試劑盒說明書步驟操作。

1.6.3 逆轉錄實時定量PCR（RT-qPCR）法檢測小腸組織occludin、ZO-1基因，肝臟組織TNF-α、INF-γ基因表達 取各組大鼠同一位置的小腸50 mg、肝臟100 mg，分別提取總RNA，用核酸蛋白測定儀測定吸光度D（260 nm）/D（280 nm）比值，分別計算出小腸和肝臟的RNA濃度和純度。反轉錄的操作按照Invitrogen公司M-MLV First Strand Kit提供的20 μL反應體系進行。先加入3 μg總RNA，與Random Hexamer Primer、ddH2O 配制成 12 μL 液體，70℃反應5 min，室溫靜置2 min；隨后加入含有Transcriptase的緩沖液8 μL，42 ℃反應60 min，94℃反應5 min，合成第一鏈 cDNA。根據GenBank提供的基因序列設計特異性引物，利用Primer 5.0和Beacon Designer 7.91生物軟件設計引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。基因表達的檢測按照25 μL的反應體系來添加，具體為先加入9.5 μL的ddH2O，而后分別加入1 μL的上游、下游引物，隨后繼續加入1 μL的cDNA以及12.5 μL Maxima SYBR Green/Fluorescein qPCR Master（2×）的混合物，最后放入熒光定量PCR儀進行反應。擴增步驟1：94℃×5 min；步驟2：94℃×30 s→55℃×30 s→72℃×50 s（45個循環）；步驟3：72℃×7 min。每組10個樣品，分別取1 μL作為cNDA模板擴增，運用2-△△Ct法計算各組基因相對表達量。具體計算公式為：

表1 基因引物序列Table 1 Gene primer sequence

1.6.4 免疫組化法檢測小腸組織occludin和ZO-1的表達 取小腸組織石蠟切片，常規二甲苯脫蠟，蛋白酶K 37℃消化10 min，PBS沖洗。滴加一抗4℃冰箱內孵育過夜，二抗室溫濕盒內孵育30 min，DAB顯色1 min，PBS沖洗。DAB顯色，鏡下控制顯色時間，PBS代替一抗作空白對照。免疫組化結果判斷：細胞膜和細胞質中見黃色或棕黃色染色定義為occludin和ZO-1的染色陽性。200倍光鏡下每張切片隨機選取5個視野，每個視野下隨機選取3個區域運用Image-Pro Plus 6.0軟件分析occludin和ZO-1的平均光密度（D）值。指標量化數值的升高或下降即可認定為相應蛋白表達的升高或下降。1.7 統計方法 采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析。所有計量資料均以均數±標準差(±s)表示，采用單因素方差分析各組間均值的差異，方差齊時，均值的比較采用SNK法檢驗，方差不齊時，均值間的比較采用Dunnett T3法檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般情況 假手術組大鼠營養狀態良好，好動，皮毛光澤，飲食飲水正常，精神狀態良好。造模組大鼠精神不佳，皮毛光澤差，自主活動減少。與模型組比較，中藥灌胃、灌腸組的大鼠自主活動均有明顯增加，精神狀況有所改善。說明調胃承氣湯灌胃、灌腸均可以改善GOS大鼠的精神狀態、飲食飲水等情況。

2.2 病理結果 圖1結果顯示：正常組小腸黏膜結構基本正常，絨毛結構完整有序，無炎性組織的浸潤；模型組腸上皮固有層萎縮變薄，絨毛組織出現了壞死且間隙增大，小腸組織受損嚴重；中藥灌胃高、低劑量組與中藥灌腸高、低劑量組小腸組織結構基本完整，沒有出現絨毛組織壞死的現象，且上皮固有層萎縮有改善的跡象。

圖1 各組小腸病理結構比較（HE染色，×100）Figure 1 Comparison of the pathological features of small intestinal tissues in various groups（by HE staining，×100）

2.3 ELISA結果 表2結果顯示，與假手術組比較，模型組血清PCT和D-LA水平明顯升高（P＜0.01），表明模型大鼠小腸黏膜屏障受損嚴重，細菌感染明顯，提示GOS模型復制成功；與模型組比較，中藥各治療組均能顯著降低PCT和D-LA的水平（P＜0.05或P＜0.01），其中，中藥灌腸高劑量組的作用較中藥灌胃組更加明顯（P＜0.01），表明調胃承氣湯能降低GOS大鼠PCT和D-LA血清含量，且灌腸給藥途徑的療效比灌胃給藥更好。

表2 各組大鼠血清PCT、D-LA含量比較Table 2 Comparison of serum contents of PCT and D-LA in various groups (±s)

表2 各組大鼠血清PCT、D-LA含量比較Table 2 Comparison of serum contents of PCT and D-LA in various groups (±s)

①P＜0.01，與假手術組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型組比較；④P＜0.05，⑤P＜0.01，與中藥灌胃高劑量組比較；⑥P＜0.01，與中藥灌胃低劑量組比較

D-LA[c/（nmol·mL-1）]0.18±0.02 0.37±0.04①0.29±0.04③0.27±0.03③0.21 ± 0.04③⑤⑥0.24± 0.03③④組別假手術組模型組中藥灌胃高劑量組中藥灌胃低劑量組中藥灌腸高劑量組中藥灌腸低劑量組N8 8 8 8 8 8 PCT[ρ/（pg·mL-1）]88.35±9.71 142.00±7.90①114.19±14.76②112.07±34.05②92.75 ± 35.18③⑤⑥103.15±32.21③

2.4 RT-qPCR結果 表3結果顯示，與假手術組比較，模型組小腸組織occludin和ZO-1基因的相對表達水平均明顯降低（P＜0.01），肝臟組織TNF-α和INF-γ基因相對表達水平明顯升高（P＜0.01）。表明模型大鼠的腸上皮細胞的緊密結合蛋白基因表達異常，腸黏膜屏障有一定程度損傷，且體內的炎癥水平升高。與模型組比較，中藥各治療組肝臟組織中TNF-α和INF-γ基因相對表達水平明顯下降（P＜0.01），中藥灌胃高劑量組與中藥灌腸高、低劑量組小腸組織occludin和中藥各治療組小腸組織ZO-1基因相對表達水平明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），且中藥灌腸高劑量組的上調作用較中藥灌胃組更明顯（P＜0.01）。表明調胃承氣湯灌胃、灌腸均能上調GOS大鼠腸上皮細胞緊密結合蛋白occludin和ZO-1的表達，修復腸黏膜屏障，并且降低體內炎癥水平。

2.5 免疫組化染色結果 圖2～4結果顯示：正常組occludin和ZO-1在腸上皮組織中均呈明顯的陽性表達，為棕色和棕褐色。模型組occludin在上皮組織中也呈陽性表達，較正常組有所減少（P＜0.05），但可見腸內也出現了明顯的陽性表達，表

表3 各組小腸occludin、ZO-1，肝臟TNF-α、INF-γ基因表達比較Table 3 Comparison of gene expression of occludin，ZO-1 in small intestinal tissues and TNF-α，INF-γ in liver tissues of various groups （±s，p）

表3 各組小腸occludin、ZO-1，肝臟TNF-α、INF-γ基因表達比較Table 3 Comparison of gene expression of occludin，ZO-1 in small intestinal tissues and TNF-α，INF-γ in liver tissues of various groups （±s，p）

INF-γ/18S 1.01±0.17 2.01±0.39①1.21±0.15③1.01±0.14③1.04±0.15③0.91± 0.18③④組別假手術組模型組中藥灌胃高劑量組中藥灌胃低劑量組中藥灌腸高劑量組中藥灌腸低劑量組N8 8 8 8 8 8 occludin/18S 1.00±0.22 0.48±0.21①0.82±0.19②0.63±0.19 1.20 ± 0.36③⑤⑥1.00± 0.20③⑤ZO-1/18S 1.00±0.28 0.53±0.24①0.86±0.25②0.89±0.20②1.56 ± 0.39③⑤⑥1.20±0.28③TNF-α/18S 1.00±0.22 2.00±0.36①1.15±0.19③0.96±0.19③0.87±0.16③1.01±0.20③

圖2 各組小腸occludin蛋白表達比較（免疫組化，×400）Figure 2 Comparison of the expression of occludin in small intestinal tissues of various groups（by immunohistochemistry，×400）

圖3 各組小腸ZO-1蛋白表達比較（免疫組化，×400）Figure 3 Comparison of the expression of ZO-1 in small intestinal tissues of various groups（by immunohistochemistry，×400）

①P＜0.01，與假手術組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型組比較；④P＜0.05，⑤P＜0.01，與中藥灌胃高劑量組比較；⑥P＜0.01，與中藥灌胃低劑量組比較明occludin內移，ZO-1在腸黏膜基本上無明顯棕褐色的分布（P＜0.05），腸內也無轉移的跡象。中藥各治療組occludin和ZO-1均有不同程度的陽性表達（P＜0.05或P＜0.01），沒有出現往腸內轉移的現象，且在中藥灌胃治療組和中藥灌腸治療組中無明顯的差異（P＞0.05）。

圖4 各組大鼠小腸occludin、ZO-1蛋白免疫組化量化結果Figure 4 Comparison of the quantization of immunohistochemical expression of occludin，ZO-1 in small intestinal tissues of various groups

3 討論

中醫學認為，膿毒癥的病機主要是溫邪熱毒，脾胃氣虛，故治則以清熱解毒、健脾益氣為主[10]。調胃承氣湯出自《傷寒論》，由大黃、芒硝、炙甘草組成，為瀉下劑的代表方。方中：大黃苦寒以泄熱通便，蕩滌腸胃；芒硝咸寒以瀉下除熱，軟堅潤燥；炙甘草以調和大黃、芒硝相須之功，使之和緩。三藥共奏緩下熱結之功，標本兼治，適用于無論是早期還是晚期腸道膿毒癥[11]。文獻研究表明，清熱解毒劑治療膿毒癥的機制有以下2個方面：一是抑制血清中內毒素及炎性介質的產生，提高組織器官抗炎抗氧化能力[12]；二是抵抗膿毒癥時細菌或內毒素易位[13]。由于腸道功能受損，臨床上口服中藥方劑存在生物利用度差的問題，灌腸療法能提高臨床療效，已被廣泛應用[14]。

腸道屏障是腸道具有特異選擇性的屏障系統，能保護機體免受外源性抗原的損害，在維持機體內環境的穩定方面起關鍵性作用。緊密連接（tight junction，TJ）是腸上皮細胞間的主要連接方式，而緊密連接蛋白（TJP）則是對其連接功能的表達，TJ對保持腸上皮細胞的極性及調節腸屏障的通透性起著非常重要的作用。已有大量文獻證明，跨膜蛋白occludin是腸上皮細胞間重要的TJP之一，相對分子質量為65 000，因具有4個跨膜結構，可以將其分為2個細胞外環和2個細胞內環，相鄰細胞就是通過外環以拉鏈狀結合而封閉細胞旁間隙。而胞質附著蛋白ZO-1，同樣作為關鍵的TJP，能與occludin結合，形成穩定的連接，從而維持腸道屏障的穩定性[6]。

當腸道暴露在細菌的感染時，大量的細胞炎性因子如TNF-α和INF-γ被釋放，引起TJP分布異常、表達減少，可導致緊密連接結構和功能的異常，細胞間隙增寬，從而導致內皮層通透性升高，為細菌移位創造了機會，而移位后的細菌繼續刺激免疫細胞分泌炎性因子，故形成惡性循環[15，16]。

PCT和D-LA作為GOS正相關的代謝標志物，在血液中大量積聚。有文獻報道，血液中D-LA的含量與腸黏膜損傷評分呈顯著正相關[17]。

本研究結果顯示，GOS模型大鼠出現明顯的膿毒癥癥狀，具體表現為血液中特異性標志物PCT和D-LA水平升高，肝臟炎性因子表達上調，小腸中TJP表達異常和結構損傷等。而調胃承氣湯灌腸療法較灌胃療法能更顯著地降低PCT和D-LA在血液中的含量、炎性因子表達及上調小腸組織中TJP的表達，防止細菌移位對機體造成更大的損傷。本研究結果為臨床上中藥灌腸療法防治GOS提供了實驗依據。