銀杏葉多酚物質(zhì)不同提取方法的比較研究

向靜， 劉付明亮， 崔旭蘭， 陳錦桃， 何杜朋， 袁勁松

（1.南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東深圳 518000；2.北京大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東深圳 518000）

銀杏葉為銀杏科植物銀杏（Ginkgo biloba L.）的干燥葉，銀杏被譽(yù)為植物界的“活化石”。據(jù)《本草綱目》等古代醫(yī)書記載，其性平、味甘苦，具有活血化瘀、通絡(luò)止痛、斂肺平喘、化濁降脂之功效。

多酚類化合物是指分子結(jié)構(gòu)中有若干個(gè)酚性羥基的植物成分的總稱，包括黃酮類、單寧類、酚酸類以及花色苷類等種類[1]，具有降血糖、降血脂、抗炎、抗腫瘤及抗病毒等生物活性[2，3]。現(xiàn)代研究表明，銀杏葉中含有黃酮類、銀杏酚酸等多酚類化合物，表現(xiàn)出良好的活性作用，具有十分可觀的藥用價(jià)值和潛在的醫(yī)藥開發(fā)前景。目前關(guān)于銀杏葉多酚類化合物單一提取方法的工藝研究時(shí)有報(bào)道，但不同提取方法間的比較及新技術(shù)的聯(lián)用尚無(wú)相關(guān)研究闡述。因此，本研究以多酚提取物得率及含量為指標(biāo)，比較乙醇提取法、酶法—乙醇提取法、超聲波—乙醇提取法、微波—乙醇提取法對(duì)銀杏葉多酚成分的影響，為其進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供借鑒，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料

1.1 藥物與試劑 銀杏葉由江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司提供（產(chǎn)地：山東；批號(hào)：1702001），經(jīng)北京大學(xué)深圳醫(yī)院主任中藥師袁勁松鑒定為銀杏科植物銀杏（Ginkgo biloba L.）的干燥葉子。沒(méi)食子酸對(duì)照品（由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，批號(hào)：110831-201605）；福林—酚（Folin-Ciocalteu）試劑[生工生物工程（上海）股份有限公司]、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、無(wú)水碳酸鈉、纖維素酶均為分析純；水為超純水。

1.2 儀器 UV-1700紫外分光光度計(jì)[島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司]；DL-720E超聲儀（上海之信儀器有限公司）；WG900CSL23-K6微波爐（佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司）；高速離心機(jī)（安徽中佳中科科學(xué)儀器有限公司）；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；DZF-6050真空干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-D循環(huán)水真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）；CP-225D十萬(wàn)分之一電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；BS-224S萬(wàn)分之一電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 銀杏葉多酚成分的制備 將銀杏葉烘干、粉碎、過(guò)80目篩，備用。

2.1.1 乙醇提取法[4，5]稱取銀杏葉粉末50 g，平行3份，加入20倍量體積分?jǐn)?shù)70%乙醇浸泡1 h，90℃加熱提取3次，每次2 h；將提取液趁熱抽濾，取上清液濃縮至一定程度，65℃真空干燥，即得銀杏葉多酚物質(zhì)。

2.1.2 酶解—乙醇提取法[6，7]稱取銀杏葉粉末50 g，平行3份，加入20倍量體積分?jǐn)?shù)70%乙醇和0.5%纖維素酶浸泡1 h，90℃加熱回流提取3次，每次2 h，余者操作同上。

2.1.3 超聲波—乙醇提取法[8，9]稱取銀杏葉粉末50 g，平行3份，加入20倍量體積分?jǐn)?shù)70%乙醇浸泡1 h，90℃加熱超聲（功率350 W）提取3次，每次0.5 h，余者操作同上。

2.1.4 微波—乙醇提取法[10，11]稱取銀杏葉粉末50 g，平行3份，加入20倍量體積分?jǐn)?shù)70%乙醇浸泡1h，微波加熱（功率500W）提取3次，每次10min。余者操作同上。

2.2 銀杏葉多酚提取物得率計(jì)算 按“2.1”項(xiàng)下方法操作，以每種提取方法平行制備6份樣品，將所得銀杏葉多酚提取物烘干至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量，與原藥材質(zhì)量相比計(jì)算得率（p）：p（%）=m1/m2×100%。其中：m1為多酚提取物質(zhì)量，m2為藥材質(zhì)量。

由不同提取方法所制備的銀杏葉多酚提取物得率由高至低依次為：酶解—乙醇提取法＞超聲波—乙醇提取法＞乙醇提取法＞微波—乙醇提取法。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，與乙醇提取法比較，酶解—乙醇提取法、超聲波—乙醇提取法得率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 不同提取方法的銀杏葉多酚提取物得率比較Table 1 Comparison of the yields of polyphenols extracted from Folium Ginkgo by different extraction methods （n=6）

2.3 銀杏葉多酚含量測(cè)定[12，13]

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取沒(méi)食子酸對(duì)照品10.13 mg，加入超純水溶解、定容于100 mL容量瓶中，配制成含沒(méi)食子酸濃度為0.101 3 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取乙醇提取法、酶解—乙醇提取法、超聲波—乙醇提取法、微波—乙醇提取法制備的銀杏葉多酚提取物20.05、20.12、20.13、20.06 mg，加入超純水溶解、定容于100 mL容量瓶中，配制成含樣品濃度分別為0.200 5、0.201 2、0.201 3、0.200 6 g/L的供試品溶液。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別精密吸取沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于容量瓶中，加入超純水0.9、0.8、0.7、0.6、0.5 mL，再加福林—酚試劑、10%碳酸鈉溶液各1.0 mL，超純水定容至刻度，充分搖勻，室溫下遮光反應(yīng)30 min；同時(shí)，取超純水1.0 mL，同法同量加入福林—酚試劑、10%碳酸鈉溶液，作為空白對(duì)照；于760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[D（λ）]值。每個(gè)樣品平行6份，以吸光度值為縱坐標(biāo)、沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，計(jì)算得回歸方程Y=0.186 5X+0.019 5（R2=0.998 9），表明在10.0～50.0 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of gallic acid

2.3.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液0.3 mL，按“2.3.3”項(xiàng)下操作進(jìn)行反應(yīng)，于760 nm處連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算得平均吸光度值為0.576，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（sR）=0.51%，結(jié)果表明該法的精密度良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取乙醇提取法制備的銀杏葉多酚提取物20 mg，平行6份，按“2.3.2”項(xiàng)下制備成樣品溶液；精密吸取0.3 mL樣品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下操作進(jìn)行反應(yīng)后于760 nm處測(cè)定吸光度值，計(jì)算得平均吸光度值為0.545，sR=0.53%，結(jié)果表明該法的重復(fù)性良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.3.2”項(xiàng)下乙醇提取法的銀杏葉多酚供試品溶液0.3 mL，按“2.3.3”項(xiàng)下操作進(jìn)行反應(yīng)后每隔1 h于760 nm處測(cè)定吸光度值，連續(xù)6 h，計(jì)算得平均吸光度值為0.544，sR=0.59%，結(jié)果表明該法的穩(wěn)定性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取已知濃度的乙醇提取法制備的銀杏葉多酚提取物樣品溶液（0.200 5 g/L）0.1 mL，分別加入質(zhì)量濃度0.101 3 g/L的沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液0.07、0.09、0.11 mL和超純水0.83、0.81、0.79 mL，混勻后加入福林—酚試劑、10%碳酸鈉溶液各1.0 mL，超純水定容至刻度，充分搖勻，室溫下遮光反應(yīng)30 min；于760 nm處測(cè)定吸光度值，計(jì)算得平均回收率分別為98.99%、98.37%、98.34%，sR為0.87%、0.67%、0.33%，結(jié)果表明該法準(zhǔn)確性良好。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results for recovery test （n=3）

2.3.8 不同提取方法的銀杏葉多酚含量測(cè)定 精密吸取“2.3.2”項(xiàng)下不同提取方法的銀杏葉多酚溶液0.3 mL，平行6份，按“2.3.3”項(xiàng)下操作進(jìn)行反應(yīng)后于760 nm處測(cè)定吸光度值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出多酚含量，同時(shí)利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)乙醇提取法與其他3種方法進(jìn)行T檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，4種不同提取方法所制備的銀杏葉多酚含量均較高，含量高低依次為：酶解—乙醇提取法（6.89±1.04）%＞超聲波—乙醇提取法（6.71±0.06）%＞微波—乙醇提取法（5.97±1.00）%＞乙醇提取法（5.42±0.06）%。與乙醇提取法比較，其他3種方法提取的銀杏葉多酚含量均升高（P＜0.05或P＜0.01），尤以酶解—乙醇提取法、超聲波—乙醇提取法更為明顯。

表3 不同提取方法的銀杏葉多酚含量比較Table 3 Comparison of the contents of polyphenols extracted from Ginkgo Folium by different extraction methods （n=6）

3 討論

本研究采用新技術(shù)酶解法、超聲波法、微波法輔助乙醇提取法進(jìn)行銀杏葉多酚成分的制備，結(jié)果表明，不同提取方法所得銀杏葉多酚含量及提取物得率不一，就提取物得率而言，以酶解—乙醇提取法最高（12.71±0.09）%，其次為超聲波—乙醇提取法（12.45±0.11）%、乙醇提取法（11.78±0.13）%、微波—乙醇提取法最低（11.39±0.10）%。就含量而言，則以酶解—乙醇提取法最高（6.89±1.04）%，其次為超聲波—乙醇提取法（6.71±0.06）%、微波—乙醇提取法（5.97±1.00）%、乙醇提取法最低（5.42±0.06）%。提示新技術(shù)、新方法的創(chuàng)新集成應(yīng)用，對(duì)制備銀杏葉多酚成分可以起到顯著的協(xié)同增強(qiáng)效果。

與傳統(tǒng)提取方法相比，新技術(shù)新方法具有耗能少、時(shí)間短、效率高等特點(diǎn)[14]。本研究結(jié)果表明，在提取時(shí)間方面，乙醇提取法=酶解—乙醇提取法＞超聲波—乙醇提取法＞微波—乙醇提取法；而在指標(biāo)成分提取率方面，酶解—乙醇提取法＞超聲波—乙醇提取法＞微波—乙醇提取法＞乙醇提取法。其中：超聲提取法主要利用超聲波的空化作用、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)等加速胞內(nèi)有效物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散和溶解；微波提取法以高頻電磁波穿透至介質(zhì)內(nèi)部，通過(guò)熱能轉(zhuǎn)化提高細(xì)胞內(nèi)部壓力，促使細(xì)胞破裂而釋放有效物質(zhì)；酶法則通過(guò)專一高效的活性酶來(lái)水解特定的某種物質(zhì)結(jié)構(gòu)，使其目標(biāo)成分有效釋放。由此可見(jiàn)，改變傳統(tǒng)單一方法制備模式，創(chuàng)新應(yīng)用現(xiàn)代化技術(shù)方法進(jìn)行有機(jī)集成，將是未來(lái)中藥有效成分制備的發(fā)展趨勢(shì)。