不同林齡油茶人工林土壤酶化學計量及其影響因素

喬 航,莫小勤,羅艷華,劉興元,胡亞軍,陳香碧,蘇以榮,*

1 中國科學院亞熱帶農業生態研究所,農業生態系統過程重點實驗室,長沙 410125 2 邵陽縣林業局,邵陽 422100

土壤酶是一類主要源自土壤微生物且具有生物催化活性的物質,是微生物參與土壤生物化學地球循環的載體,也是土壤生態系統物質轉化的核心動力[1]。碳(C)、氮(N)和磷(P)是土壤養分循環的核心要素[2],土壤C、N、P 轉化酶對土壤中的C、N、P 元素轉化和遷移具有重要作用。基于生態化學計量學原理,生態系統中任何生物組成物質都是由C、N、P和其他元素按照一定比例組成,并且不同營養層級生物在物質能量傳遞過程中存在特定的化學計量關系[3]。土壤微生物為滿足生理上C、N、P 合理比率的需求,將分泌與之對應的胞外酶將土壤中有機態C、N、P 轉化為可利用的小分子或者無機養分[4-5]。土壤微生物分泌碳轉化酶主要包括β-葡糖苷酶(BG)、α-纖維素酶(CBH)和多酚氧化酶(PPO)等；氮轉化酶主要包括β-乙酰葡糖胺糖苷酶(NAG)、亮氨酸氨基肽酶(LAP) 和脲酶(Urease)等；磷轉化酶主要包括磷酸單酯酶(AP)和磷酸雙酯酶(PD)等,這些微生物胞外酶的活性與微生物代謝、土壤養分含量密切相關,微生物胞外酶比值反應了微生物對養分的需求差別,Sinsabaugh 等也由此提出了土壤酶化學計量的概念[6-7]。目前的研究常將微生物酶的ln(CBH+BG)∶ln(NAG+LAP)、ln(BG+CBH)∶ln(AP)和ln(NAG+LAP)∶ln(AP)與土壤的C∶N、C∶P 和N∶P 相聯系,用于評價微生物養分利用、微生物群落新陳代謝和養分需求,并在一定程度上指示土壤養分有效性[8]。在全球尺度上,Sinsabaugh 等發現總體上土壤C、N、P 酶化學計量比遵循1∶1∶1 的關系(ln(CBH+BG)∶ln(NAG+LAP)∶ln(AP)=1∶1∶1),揭示了土壤酶化學計量比對生物地球化學循環的重要影響[9]。

在特定的生態系統中,土壤微生物的生長受到環境脅迫和養分的限制,其酶的表達受到環境狀況的調控,可能不遵循1∶1∶1 的關系。以往研究表明,非生物因子與生物因子均能影響土壤酶化學計量比[10]。例如：Sardans 等通過長期研究,發現增溫會不同程度的增加灌叢生態系統土壤酶化學計量比ln(BG+CBH)∶ln(AP)和ln(NAG+LAP)∶ln(AP)的值[11-12]。土壤理化性質,如pH、全磷等也能夠影響土壤酶化學計量比[13-14],例如：Xu 等對我國不同區域森林土壤研究表明,隨著pH 增大,土壤酶化學計量比ln(BG+CBH)∶ln(AP)和土壤酶化學計量比ln(NAG+LAP)∶ln(AP)呈減小趨勢[15]。Peng 等對我國溫帶草原研究發現全磷與土壤酶化學計量比ln(NAG+LAP)∶ln(AP)呈顯著正相關[16]。此外,土壤酶還受地上植被等生物因子的影響[17]。植被可通過凋落物和根系分泌物對土壤酶化學計量產生影響[18]。例如：王冰冰等發現岷江干旱地區飛虹樣地內灌叢地ln(BG)∶ln(NAG+LAP)顯著高于空地[19]。在不同的生態系統中,影響土壤酶化學計量的因素可能完全不同,因此特定生態系統中土壤酶化學計量的控制因子仍值得我們研究。

油茶(CamelliaoleiferaAbel.),屬山茶屬(CamelliaL.)山茶科(Theaceae)植物,為常綠小喬木或灌木,是我國特有木本食用油料樹種,是世界四大木本油料之一[20]。油茶主要生長在我國南方亞熱帶區丘陵地帶,具有較強經濟價值,也具有較強的生態功能。油茶人工林作為中國獨有的經濟林生態系統,目前已有的研究側重于油茶栽培和育種等[21],如不同地塊上肥料配比對油茶生長的影響[22],這些單個肥料試驗由于立地條件、土壤肥力的差別,結果差異較大,缺乏對亞熱帶區油茶人工林養分需求的宏觀理解。本文在區域尺度上,以中國亞熱帶油茶人工林為研究對象,測定土壤C、N、P 轉化酶活性及土壤基本理化性質,從生態化學計量學的角度解析土壤微生物養分限制因子,旨在提高人們對油茶人工林的養分限制狀況的理解,亦為油茶人工林可持續經營管理提供理論指導。有研究表明：林齡的變化顯著改變土壤環境,如：檉柳人工林隨林齡增加,土壤結構改善,有機質增加[23],這些生態系統組成結構、內部環境及土壤性質的改變,養分分配格局的變化,深刻的影響土壤酶活性及土壤酶化學計量比[24]。此外,油茶人工林由于果實采摘帶走N、P 養分,這勢必造成不同林齡土壤微生物可利用養分的差別,從而改變土壤微生物養分限制因子。因此本文探究林齡是否影響土壤酶活性與酶活性化學計量,為油茶人工林的土壤養分狀況管理研究提供科學理論依據。

1 研究方法

1.1 樣地選擇和研究區概況

圖1 樣點信息圖Fig.1 Soil sampling sites

試驗研究區位于湖南、江西和湖北三省。該地區為中國油茶的主產區,油茶面積分別為1.4×106hm2[25]、8.9×105hm2[26]和2.5×105hm2[27],屬典型亞熱帶季風氣候區,夏季高溫多雨,冬季溫和少雨,年平均氣溫17 ℃,極端最高溫39 ℃,極端最低溫度-10 ℃,年平均降水量約1600 mm。本試驗采用隨機取樣法在該區域內共選擇32 個樣地(圖1),其中湖南省21 個,江西省7 個,湖北省4 個。樣地土壤類型主要以紅壤為主,土壤質地以壤質黏土為主(表1)。根據油茶人工林的林齡分為四個林齡組,其中< 9 年(a)油茶幼齡林9 個,9—20 年(a)油茶近熟林10 個,21—60 年(a)油茶成熟林6 個,> 60 年(a)油茶過熟林7 個。

1.2 研究方法

1.2.1樣品采集與處理

土壤樣品于2017 年12 月至2018 年1 月在選擇的32 個典型油茶人工林樣地中采集,每個油茶人工林樣地中設置3 個10 × 10 m 的樣方。在每個樣方內選擇生長狀況相近的三棵油茶樹,在每棵油茶樹的滴水線內距基部20—30 cm 之間隨機取4 個點,取0—15 cm 表層土壤,每個樣方內三棵油茶樹土壤混合成一個土壤樣品。每個樣地內采集三個土壤樣品作為重復,32 個試驗樣地共采集96 個土壤樣品。土壤樣品帶回實驗室后挑揀出可見根系及石子,過2 mm 篩,充分混合并分為兩份子樣。一份子樣自然風干用于測定土壤基本理化性質,一份子樣用于測定土壤C、N、P 酶活性。在測定土壤酶活性之前,土壤進行培養。取300 g 土壤調整至田間持水量的40 %,在25 ℃條件下黑暗靜置培養15 d,測定土壤酶活性。

1.2.2土壤酶活性測定

參照Saiya-Cork 等[28]的熒光光度法測定土壤酶活性。本研究測定了五種酶活性,分別為β-葡糖苷酶(BG)、α-纖維素酶(CBH)、β-乙酰葡糖胺糖苷酶(NAG)、亮氨酸氨基肽酶(LAP)、酸性磷酸酶(AP)。酶活性測定的簡要步驟為：稱取新鮮土壤1 g 于200 mL 滅菌樂扣盒中,加入125 mL 50 mmol/L 的醋酸鈉緩沖液(pH=5),磁力攪拌5 min 使之均質化。使用移液器向96 孔酶標板中分別對應加入250 μL 緩沖液、200 μL 土壤勻漿樣品、50 μL標物、50 μL 底物。置于25 ℃黑暗條件下培養4 h后,加入10 μL 1 mol/L 的NaOH 終止反應。采用多功能酶標儀(SynergyH4,BioTek)測定其熒光度。每種酶活性底物如表2 所示。

表1 樣地基本概況

1.2.3土壤理化性質測定

土壤pH 值采用風干土加去CO2蒸餾水(土水比：1∶2.5,W/V)浸提15 min,用Mettler-toledo 320 pH 計測定；土壤有機碳(SOC)采用外加熱法(油浴溫度為180 ℃,沸騰5 min),用重鉻酸鉀-硫酸溶液氧化有機碳,剩余重鉻酸鉀用硫酸亞鐵溶液滴定,從所消耗的重鉻酸鉀量計算有機碳含量；全氮(TN)采用半微量開氏法-流動注射儀分析測定,將風干土樣加入高錳酸鉀用濃硫酸消煮,經高溫分解,轉化為硫酸銨后冷卻洗出,用流動注射分析儀(AA3)自動上機測定氮濃度；全磷(TP)采用氫氧化鈉熔融-鉬銻抗比色法測定,將風干土樣與氫氧化鈉熔融,使得土壤中含磷礦物及有機磷礦物全部轉化為可溶性的正磷酸鹽,用水洗出,冷卻定容,將樣品溶液與鉬銻抗顯色劑反應,生成磷鉬藍,用分光光度計在700 nm 波長比色,讀取吸光值；速效磷(Olsen-P)采用碳酸氫鈉-鉬銻抗顯色法,用0.5 mol/L碳酸氫鈉加入風干土樣,震蕩培養30 min,過濾,取樣品溶液與鉬銻抗顯色劑反應,生成磷鉬藍,用分光光度計在882 nm 波長比色,讀取吸光值[29]。

表2 土壤酶種類、縮寫以及底物

1.3 數據分析

采用SPSS 19.0 進行數據處理和數據分析,不同林齡土壤理化性質、土壤酶活性及其計量比采用單因素方差分析(One-way ANOVA)中的Duncan 法檢驗；采用Pearson 相關分析土壤酶活性、土壤酶化學計量比與土壤理化性質之間的關系；采用Canoco 5 軟件以土壤酶活性和土壤酶化學計量比為響應變量,土壤基本理化性質及C、N、P 元素計量比為解釋變量進行冗余分析(RDA)。圖表數據均采用平均值±標準差表示。

2 結果分析

2.1 不同林齡油茶人工林土壤理化性質

油茶人工林土壤pH 值都較低(pH < 5),21—60 a 林齡組的土壤pH 顯著高于< 9 a、21—60 a 和> 60 a 林齡組。SOC 含量隨林齡增大而增加(P< 0.05),但在21—60 a 和> 60 a 林齡組間差異不顯著；TN 含量隨林齡的增大有一定程度的增加,< 9 a 林齡組顯著低于其余三個林齡組；土壤TP 和Olsen-P 在各林齡組中無顯著差異(表3)。

表3 不同林齡油茶人工林土壤基本理化特征

不同小寫字母代表差異性顯著(P< 0.05); SOC：土壤有機碳 soil organic carbon；TN：總氮 total nitrogen；TP：總磷 total phosphorus；Olsen-P：速效磷Olsen phosphorus

2.2 不同林齡油茶人工林土壤酶活性及酶化學計量比特征

總體上,土壤酶活性隨林齡增大都有一定程度增加(圖2),BG 活性在> 60 a 林齡組中最高,與9—20 a 和21—60 a 林齡組沒有顯著差異,但顯著高于< 9 a 林齡組；CBH 活性在< 9 a 和9—20 a 沒有顯著差異。21—60 a 和> 60 a 林齡組CBH 活性沒有顯著差異,且顯著高于< 9 a 和9—20 a 林齡組；NAG 在< 9 a 林齡組中活性最低,在9—20 a 和21—60 a 無顯著差異,> 60 a 林齡組顯著高于其他三個林齡組；LAP 和AP 活性在< 9 a 林齡組中活性最低,在9—20 a、21—60 a 和> 60 a 三個林齡組中均無顯著差異。土壤酶C∶N∶P 化學計量比用ln(CBH+BG)∶ln(NAG+LAP)∶ln(AP)表示,總體上亞熱帶區油茶人工林土壤酶化學計量C∶N∶P 為1∶1∶1.5。土壤酶化學計量比C∶N 在一定的林齡內(< 60 a)具有增加的趨勢；土壤酶化學計量比C∶P 在四個林齡組中均無顯著差異；土壤酶化學計量比N∶P 在> 60 a 林齡組顯著高于其他三個林齡組(圖3)。

2.3 土壤理化因子對土壤酶活性及土壤酶化學計量比的影響

從整體上看,油茶人工林土壤的C、N、P 轉化酶活性之間呈顯著正相關關系(圖4)。土壤酶活與土壤理化性質之間的相關性分析表明：五種酶活性與SOC 和TN 都呈顯著正相關。LAP 和CBH 與pH 呈顯著正相關,而AP 和pH 為顯著負相關。土壤酶化學計量比C∶N僅與土壤N∶P 呈正相關；土壤酶化學計量比C∶P 和N∶P 與土壤C∶N 呈顯著正相關(P< 0.05,表4)。RDA 排序圖結果顯示,第1 軸和第2 軸的解釋變量分別為40.05%和0.73%,土壤SOC(F=38.1;P=0.002)、TP(F=5.9;P= 0.016)和pH(F=4.1;P=0.03)是影響土壤酶活性和酶化學計量比的顯著影響因子,分別解釋了土壤酶活性和土壤酶化學計量比的28.9%,4.2%,2.9%的變異(圖5)。

圖2 不同林齡油茶人工林的土壤酶活性Fig.2 Soil enzyme activities in Camellia oleifera plantation at different stand ages誤差線上方不同小寫字母表示不同林齡間差異顯著(P<0.05)

圖3 不同林齡油茶人工林土壤酶化學計量比特征Fig.3 Ecoenzymatic stoichiometry in Camellia oleifera plantation at different stand ages誤差線上方不同小寫字母表示不同林齡間差異顯著(P<0.05); BG：β-葡糖苷酶β-glucosidase；CBH：α-纖維素酶 β-D-cellobiosidase；NAG：β-乙酰葡糖胺糖苷酶N-acetyl-β-glucosaminidase；AP：亮氨酸氨基肽酶 leucine aminopeptidase；AP：酸性磷酸酶 acid phosphatase；ln(CBH+BG)∶ln(NAG+LAP)表示土壤酶化學計量C∶N；ln(CBH+BG)∶ln(AP)表示土壤酶化學計量N∶P；ln(NAG+LAP)∶ln(AP)表示土壤酶化學計量N:P

圖4 不同林齡油茶人工林土壤酶化學計量關系圖Fig.4 Relationships between ecoenzymatic stoichiometry in Camellia oleifera plantation at different stand ages

酶EnzymepH有機碳SOC全氮TN全磷TP速效磷Olsen-P碳氮比C∶N碳磷比C∶P氮磷比N∶PBG-0.0190.555??0.544??0.0880.0740.365??0.359??0.272??CBH0.215?0.505??0.471??00.0610.358??0.412??0.323??NAG-0.1050.482??0.391??0.0190.0360.429??0.276??0.129LAP0.583??0.370??0.394??0.202?0.1170.1650.1010.041AP-0.219?0.538??0.505??-0.153-0.1040.355??0.513??0.424??ln(CBH+BG)∶ln(NAG+LAP)0.0550.0670.1120.0350.039-0.0250.1470.228?ln(CBH+BG)∶ln(AP)0.1970.380??0.362??0.268??0.212?0.306??0.1380.048ln(NAG+LAP)∶ln(AP)0.1560.351??0.267??0.215?0.1750.384??0.045-0.126

*在0.05水平上顯著相關,**在0.01水平上顯著相關; 碳氮比 carbon to nitrogen ratio；C:P：碳磷比carbon to phosphorus ratio；N:P：氮磷比nitrogen to phosphorus ratio

圖5 土壤酶活性和酶化學計量比與土壤理化因子的冗余分析(RDA)Fig.5 Redundancy analysis (RDA) of soil enzyme activities and ecoenzymatic stoichiometry ratios

3 討論

3.1 土壤養分和土壤酶活性對不同林齡油茶人工林的響應

林齡通過改變植被狀況和林分環境對土壤理化性質產生影響,同時通過影響凋落物的形成分解、根系分泌物含量進而改變微生物群落與數量,從而影響土壤酶活性[30-31]。不同林齡油茶人工林SOC、TN 含量及酶活性均表現為幼齡林最低,過熟林最高,這可能與不同林齡油茶人工林凋落物產量、分解速率和根系生物量不同有關[32]。隨林齡增大,林下凋落物及植物殘體增多,補充了土壤SOC 含量和TN 含量,為土壤微生物提供使其生存的碳源和氮源,微生物酶活性增加[33]。此外,隨林齡增加,長時間的土壤微生物固碳、固氮和大氣氮干濕沉降也使得土壤養分積累[34-36],微生物酶活性增加。新造油茶人工林一般采用全墾方式[37],表層土壤養分含量低,微生物量少,酶活性較低,且在油茶幼齡期間,油茶生長速率快,需要大量土壤養分以滿足自身需求,并與土壤微生物競爭氮磷養分,因此通過植物根際過程能夠提供給微生物的養分含量少。在油茶生長的中后期,油茶生長緩慢,養分積累速率下降,C、N、P 轉化酶活性緩慢增加,趨于穩定[38-40]。由此可得,隨林齡改變,土壤養分和土壤酶活性變化具有趨同性。一般而言,土壤酶活性與土壤養分含量呈顯著正相關,如呂春花等的研究,這與本文研究基本一致[41]。值得注意的是,油茶人工林的磷轉化酶活性并沒有隨著土壤磷含量的變化而變化,且活性一致處于較高水平,這可能與研究區普遍缺磷有關。本研究大部分的油茶人工林土壤Olsen-P 含量一般低于5 mg/kg,顯著低于該區域內柑橘園Olsen-P 含量(14.3 mg/kg)和茶園土壤Olsen-P 含量(11.2 mg/kg)[42]。

3.2 油茶人工林土壤酶化學計量比與土壤理化性質的關系

土壤酶化學計量受土壤C、N、P 資源有效性的調控[43]。本研究結果發現,SOC 是影響土壤酶化學計量比的關鍵因子,且相關分析結果表明土壤酶化學計量比C∶P 和N∶P 與SOC 呈顯著的正相關關系,SOC 含量越高,土壤酶化學計量比C∶P 和土壤酶化學計量比N∶P 越高,說明SOC 含量增加,能夠同時促進土壤微生物分泌C、N 轉化酶。這與曹等的研究結果增加土壤有機質,土壤蔗糖酶和幾丁質酶活性增高一致[44]。研究發現土壤酶化學計量比C∶N 為1∶1,與SOC 含量無關,表現出C、N 等速礦化的特征,這與全球尺度酶C∶N 化學計量比一致。

此外,本研究中土壤酶化學計量比還受到土壤C∶N 和N∶P 的影響。鑒于土壤酶主要來源于土壤微生物、植物根系分泌及植物降解的產物,而微生物生物量化學計量比隨土壤和植物組織養分化學計量比的改變而改變[45],導致了土壤酶化學計量比亦能夠受土壤養分化學計量比的影響。值得注意的是,土壤酶C∶N 化學計量比與土壤C∶N 無顯著相關,而土壤酶N∶P 化學計量比和C∶P 化學計量比均與土壤C∶N 顯著相關,表明了土壤酶化學計量與土壤元素計量不存在嚴格的對應關系,體現了土壤酶化學計量關系的復雜性。土壤酶化學計量比并不能夠很好的反映土壤元素的比例組成,可能的原因之一是土壤元素的計量比不能表征有效態養分的計量比,此外,一些未測量因子如土壤溫度、土壤水分可能間接的調控了土壤酶化學計量比[46-47]。

3.3 油茶人工林土壤養分限制因子

土壤酶化學計量比是指示微生物養分限制的重要因子,土壤C、N、P 轉化酶活性對數轉換后的比值為1∶1∶1.5,與全球生態系統1∶1∶1 的比值相偏離[13],表明研究區域內具有較高的P 轉化酶活性,從而反應了研究區內土壤P 素的相對缺乏。微生物為滿足自身P 的需求,將分泌更多的P 轉化酶礦化土壤中的有機磷,本研究結果與大多數的研究認為亞熱帶地區磷是生態系統生產力的限制因子一致[48-49]。全球范圍內,土壤全磷含量平均為0.5 g/kg,遠大于亞熱帶地區全磷含量(0.35 g/kg),且亞熱帶地區土壤高度風化呈酸性,土壤磷被含量較高的活性鐵和鋁強烈吸附,形成難溶性磷酸鐵和磷酸鋁等,導致亞熱帶地區有效磷含量低[50]。本研究還發現,四個林齡組土壤酶活性比(CBH+BG)∶(AP)和土壤酶活性比(NAG+LAP):(AP)均顯著低于全球尺度上土壤酶活性比(CBH+BG)∶(AP)(0.62)和(NAG+LAP):(AP)(0.44)[13],說明所有林齡油茶人工林土壤均存在磷限制。此外,隨林齡增加土壤P 轉化酶活性有增加趨勢,表明成年林土壤較幼齡林土壤磷限制更嚴重,這可能的原因是長期的油茶果實采摘帶走的磷素導致土壤磷缺乏趨于嚴重。

4 結論

亞熱帶區不同林齡油茶人工林生態系統的C、N、P 轉化酶活性存在顯著差異。土壤C、N、P 轉化酶活性隨林齡增大均有一定程度增加。在四個林齡組中,P 轉化酶的活性均高于C 和N 轉化酶活性。整體上,油茶人工林土壤酶活C∶N∶P 計量比值為1∶1∶1.5,與全球生態系統中土壤酶活C∶N∶P 計量比1∶1∶1 的比值發生偏離,表明該區域的油茶人工林土壤受P 限制。土壤SOC 含量是驅動土壤酶活性和改變酶化學計量比的關鍵因子。因此,在油茶人工林經營管理中,應長期注重磷養分以及有機物料的添加管理。