陽離子樹脂種類及用量對桑葉中1-脫氧野尻霉素純化效果

石萬銀，王玉，王道清，徐劍，陳志元，江丹

勁牌生物醫藥有限公司，湖北 黃石 435000

桑葉為桑科植物桑MorusalbaL.的干燥葉[1]。初霜后采收，除去雜質，曬干。桑葉是蠶的日常食物，又名家桑、荊桑、桑椹樹、黃桑葉等，桑葉藥性平和、營養豐富，含有人體必需的多種氨基酸和維生素，被國家衛計委列為“既是食品又是藥品”名單[2]。

1-脫氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin，DNJ)是桑葉中一種哌啶類生物堿，是一種天然糖的結構類似物[3]，DNJ降血糖主要途徑表現在小腸內與α-葡萄糖苷酶結合，抑制麥芽糖、蔗糖的分解，從而使在腸道內糖分吸收量明顯下降，安全性好[3]。目前，DNJ的主要獲得途徑有天然來源和化學合成，但現有的化學合成方法存在過程復雜、條件苛刻、產率低等弊端。因此，從植物中獲得高純度DNJ成為當今研究的熱點[4]。

離子交換樹脂純化天然DNJ是目前應用較多的方法，通過離子交換原理，選擇性置換出提取液中帶相應電荷的離子或者分子，洗去雜質后再將其洗脫下來，從而實現目標成分和雜質的分離。該方法操作步驟為桑葉提取液上陽離子交換樹脂，純水洗去雜質，再用適宜濃度的氨水洗脫，收集氨水洗脫液濃縮干燥，得到含DNJ的提取物[5-6]。

本文采用前期實驗確定的桑葉DNJ純化工藝，比較了LSI-010(H型)、001×7(H型)、001×7(Na型)3種陽離子樹脂對桑葉DNJ的純化效果，并確定了001×7(Na型)陽離子交換樹脂純化桑葉DNJ的最佳用量。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1200系列高效液相色譜儀(G1311A四元梯度泵、G1329B自動進樣器、G1316A柱溫箱、蒸發光散射檢測器)；純水機(威立雅水務)；電子天平(梅特勒-托利多公司)；水浴鍋(北京市光明醫療儀器有限公司)；真空泵(vacuubrand)。

1.2 試藥

LSI-010(H型)、001×7(H型)、001×7(Na型)陽離子交換樹脂；對照品DNJ(1-脫氧野尻霉素，純度95%，批號：D101242，Aladdin)；乙腈(TEDIA，色譜純)；乙酸銨(SIGMA，色譜純)；超純水；乙醇、濃鹽酸、濃氨水、氫氧化鈉(國藥集團化學試劑有限公司，分析純)。

2 DNJ檢測方法學考察

2.1 供試品溶液的制備

精密稱取桑葉提取物20 mg，置10 mL容量瓶中，用乙腈-水(50∶50，水中含6.5 mmol乙酸銨)溶解并定容，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2 對照品溶液制備

精密稱取DNJ對照品7.00 mg于25 mL容量瓶中，用乙腈-水(50∶50，水中含6.5 mmol乙酸銨)溶解并定容至刻度，配制成DNJ質量濃度為266 mg·L-1的對照品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱：Shodex Asahipak NH2P-50色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；蒸發光散射檢測器，漂移管溫度為100 ℃，氮氣流速為2.5 mL·min-1，乙腈-6.5 mmol·L-1乙酸銨=82∶18等度洗脫，流動相流速為1.0 mL·min-1[7]。上述色譜條件下，DNJ對照品色譜圖見圖1，桑葉提取物色譜圖見圖2。

圖1 DNJ對照品HPLC圖

圖2 桑葉提取物HPLC圖

2.4 色譜柱的選擇

比較了Agilent C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Waters T3色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)和Shodex Asahipak NH2P-50色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)對DNJ對照品和桑葉提取物的分離效果，根據對照品和提取物樣品的HPLC圖分離度和對稱因子，最終確定選擇Shodex Asahipak NH2P-50色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)為檢測DNJ的色譜柱。

2.5 檢測方法學研究

2.5.1 線性范圍考察 分別精密吸取2.2項下對照品溶液1、2、3、4、5 mL于5 mL容量瓶中，用乙腈-水(50∶50含6.5 mmol乙酸銨)稀釋并定容至刻度，得到DNJ質量濃度分別為53.20、106.40、159.60、212.80、266.00 mg·L-1的對照品溶液，用0.22 μm有機相微孔濾膜過濾后作為對照品溶液備用。按照2.3的色譜條件進行色譜分析，經色譜分析分別得到各濃度DNJ對照品色譜峰的峰面積，分別以DNJ對照品溶液峰面積的對數為縱坐標，以DNJ對照品溶液濃度的對數為橫坐標建立標準曲線。DNJ的標準曲線方程：Y=0.527 266X-0.589 344，r=0.999 2。

2.5.2 精密度試驗 精密稱取桑葉提取物32.76 mg，按照2.1方法制備桑葉提取物供試品溶液，在2.3色譜條件下連續進樣分析6次，得到各次分析的DNJ色譜峰面積，計算提取物中DNJ峰面積的RSD值為1.56%。

2.5.3 穩定性試驗 取精密度試驗中的桑葉提取物的供試品溶液，分別在2.3色譜條件下于0、1、2、3、4 h進樣分析，得到桑葉提取物中DNJ的峰面積，計算DNJ峰面積的RSD值為1.32%。

2.5.4 重復性試驗 精密稱取桑葉提取物30 mg，按照2.1項下的方法制備6份桑葉提取物供試品溶液，在上述色譜條件下進行色譜分析，利用建立的標準曲線計算各供試品溶液中DNJ的含量。計算得到桑葉提取物中DNJ的平均質量分數為5.28%，RSD值為0.76%。

2.5.5 加樣回收試驗 精密稱取桑葉提取物15 mg樣品6份，分別加入相當于15 mg桑葉提取物中DNJ含量的80%、100%、120%3個梯度的DNJ對照溶液各2份，按照2.1項下的方法制備桑葉提取物供試品溶液，在上述色譜條件下進行色譜分析，利用標準曲線計算DNJ的含量及回收率。計算所得桑葉提取物中DNJ的平均回收率為96.30%，RSD值為1.58%。

3 陽離子種類及用量對DNJ純化效果考察

3.1 不同種類陽離子交換樹脂對桑葉DNJ純化效果考察

3.1.1 陽離子樹脂預處理 量取LSI-010(H型)、001×7(H型)、001×7(Na型)陽離子交換樹脂3份，每份200 mL，純水浸泡后分別裝入3根玻璃層析柱，水洗至無色，LSI-010(H型)、001×7(H型)分別用1000 mL 1 mol·L-1氫氧化鈉溶液洗脫，流速為400 mL·h-1，水洗至中性，再分別用1000 mL 1 mol·L-1鹽酸溶液洗脫，流速為400 mL·h-1，水洗至中性備用；001×7(Na型)分別用1000 mL 1 mol·L-1鹽酸溶液洗脫，流速為400 mL·h-1，水洗至中性，再分別用1000 mL 1 mol·L-1氫氧化鈉溶液洗脫，流速為400 mL·h-1，水洗至中性備用。

3.1.2 桑葉DNJ純化 稱取桑葉藥材200 g共3份，分別加入4 L純凈水，90 ℃提取兩次，每次2 h，趁熱過濾，合并兩次濾液，分別用預處理過的LSI-010(H型)、001×7(H型)、001×7(Na型)3種陽離子交換樹脂純化，流速為400 mL·h-1，提取液上樣完畢后每根樹脂柱分別用800 mL水洗，棄去水洗液，再用1000 mL 0.5 mol·L-1氨水洗，收集氨水洗脫液，濃縮干燥，稱質量，檢測DNJ含量。檢測結果見表1[8]。

3.2 001×7(Na型)陽離子交換樹脂對不同量的桑葉提取液中DNJ純化效果考察

3.2.1 陽離子樹脂預處理 量取001×7(Na型)陽離子交換樹脂5份，每份200 mL，純水浸泡后分別裝入5根玻璃層析柱，水洗至無色，分別用1000 mL1 mol·L-1鹽酸溶液洗脫，流速為400 mL·h-1，水洗至中性，再分別用1000 mL 1 mol·L-1氫氧化鈉溶液洗脫，流速為400 mL·h-1，水洗至中性備用，樹脂柱編號為1#、2#、3#、4#、5#。

表1 不同類型陽離子交換樹脂對桑葉DNJ純化結果 %

3.2.2 桑葉DNJ純化 分別稱取桑葉藥材200、300、400、600、800 g共5份，分別加入20倍體積的純凈水，90 ℃提取兩次，每次2 h，趁熱過濾，合并兩次濾液，分別用預處理過的上述5組陽離子交換樹脂純化，流速為400 mL·h-1，提取液上樣完畢后每根樹脂柱分別用800 mL水洗，棄去水洗液，再用1000 mL 0.5 mol·L-1氨水洗，收集氨水洗脫液，濃縮干燥，稱質量，檢測DNJ含量。檢測結果見表2。

表2 001×7(Na型)陽離子樹脂對不同量桑葉提取液純化效果

4 結論及討論

不同類型陽離子樹脂對桑葉DNJ純化檢測結果顯示，桑葉提取液經過3種陽離子樹脂純化后得到桑葉提取物中DNJ含量從高到低依次為001×7(Na型)>LSI-010(H型)>001×7(H型)，純化后桑葉提取物得率從高到低依次為LSI-010(H型)>001×7>(H型)001×7(Na型)，不同陽離子樹脂純化DNJ提取物得率和DNJ含量差異較大，與不同類型樹脂交聯度不一樣，對DNJ吸附和交換能力不一樣有關；采用H型陽離子樹脂提取物得率高于Na型陽離子樹脂，是由于相同質量的H型陽離子樹脂比Na型陽離子樹脂能交換更多帶正電荷的物質。

桑葉提取液不同上樣量實驗，從流出液中DNJ檢出量結果看，1倍上樣量流出液DNJ含量最少，1.5倍、2倍、3倍、4倍上樣量流出液中DNJ含量依次增大，且后期實驗證明，樹脂多次使用后，DNJ得率降低而流出液中DNJ檢出量增加，可能是由于樹脂本身破碎，功能退化或者是再生不徹底，而使純化效果變差。

采用001×7(Na型)陽離子交換樹脂進行桑葉DNJ純化后，由于樹脂上的Na離子也被部分交換下來，導致濃縮液堿性太強，提取物中Na離子含量較高，可根據需求提取物DNJ含量的高低選擇不同種類的陽離子交換樹脂進行桑葉DNJ的純化。