河北與山西產黃芩藥材中主要黃酮類成分的含量比較研究

申潔，李珮，劉雙雙，李世，王繼永，曾燕，劉海濤，何春年*，孫曉波，肖培根

1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193；2.教育部中草藥物質基礎與資源利用重點實驗室，北京 100193；3.河北旅游職業學院，河北 承德 067000；4.中國中藥有限公司，北京 100195

中藥黃芩為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，在春秋采集，始載于《神農本草經》，目前為例版《中華人民共和國藥典》所收錄。其性寒、味苦，能清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎。現代藥理學研究表明其主要活性成分為黃酮類化合物，如黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素等[1-2]，具有抗氧化[3-4]、抗菌[5]、抗病毒[6]、抗腫瘤[7-8]、保護肝臟和提高免疫[9-10]等多種藥理活性。

據賈薔等[11]報道，在《中藥部頒標準》中有477個成方制劑中含有黃芩，包含主治疾病153種。黃芩藥材臨床用量較大，國內年需量達5000多噸[12]。隨著黃芩資源需求量加大，野生資源已不能滿足社會需求，栽培黃芩已成為我國黃芩藥源的主要來源，國內已大量栽培。黃芩主要分布于長江以北大部分省區及西北和西南地區，現今習慣以河北承德為黃芩的道地產區，并認為河北承德黃芩藥材質量較好[13]，其以仿野生栽培黃芩為主。另外，現以山西產量大，為人工栽培2～3年生黃芩的主要產區[14]。目前尚未有針對兩地黃芩藥材主要化學成分的對比研究。

為更加合理的評價河北與山西兩個產區來源的黃芩藥材的質量情況，本課題組系統的收集了河北省承德市的黃芩樣品與山西省的黃芩樣品共32份。采用多組分含量測定的HPLC-DAD的方法，測定了黃芩藥材主要黃酮類化合物的含量，并比較了不同產地、不同年限、不同采收季節的黃芩藥材主要黃酮化學成分含量的差異。為黃芩優質藥材的綜合評價進一步提供了相應的實驗依據。

1 材料與儀器

1.1 材料

32批黃芩樣品均由本課題組采集或收集，原植物保存于藥用植物研究所親緣中心植物樣品陳列室，由中國醫學科學院藥用植物研究所肖培根研究員鑒定。樣品信息見表1。對照品野黃芩苷(3)、芹菜素-7-O-β-D-葡萄苷(4)、黃芩苷(5)、木犀草素(7)、漢黃芩苷(8)、山姜素(9)、芹菜素(10)、黃芩素(11)、漢黃芩素(12)、白楊素(13)和千層紙素A(14)購于中國食品藥品檢定研究院，純度均大于98%；異紅花素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(1)、紅花素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(2)、白楊素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(6)為本實驗室從黃芩中分離得到，并經UV、IR、NMR等譜學數據鑒定，HPLC檢測純度大于95%，其中化合物(1)和(2)為C(2)-R，S構型混合物，混合比例為1∶1。甲醇、乙腈為色譜純(Fisher Scientific)；甲酸(CNW公司，德國)；純凈水(Milli-Q，Millipore 公司，美國)。

1.2 儀器

Agilent 1200 HPLC(G1322A型在線脫氣機、G1311A型液相泵、G1329A自動進樣器、G1316A柱溫箱、G1315B型DAD檢測器、Agilent色譜工作站)；梅特勒-托利多電子天平(AL204)；C9860A超聲波清洗器(上海杰恩普超聲設備有限公司)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

本實驗方法采用已有的HPLC-DVD方法[15]，該方法基于HPLC-DAD多成分含量測定能夠滿足黃芩藥材樣品的測定，且儀器精密度、方法重復性、穩定性、對照品線性關系和加樣回收率等均符合要求。色譜柱為YMC-pack ODS-A(250 mm × 4.6 mm，5m)；流動相為甲醇(A)、乙腈(B)和0.1%甲酸水(C)，梯度洗脫，線性洗脫程序為：0～60 min，A-B-C(15∶5∶80)到A-B-C(80∶10∶10)。每針進樣分析完畢用初始流動相平衡15 min再進行下一針分析。流速為1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；紫外檢測波長為278 nm；進樣體積為10L。用安捷倫工作站Chemstation software(C.01.06)采集數據并分析。

2.2 供試品溶液的制備

取黃芩根部干燥樣品，粉碎、過40目篩，精密稱取粉末約0.5 g于50 mL的容量瓶中，精密加入相應體積的70%乙醇水，定容至刻度，超聲提取30 min，放置室溫，用70%乙醇水補足減少的體積，0.45m濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.3 混合對照品溶液的制備

分別精密稱取14個對照品適量，置10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混勻，得到各對照品的儲備液。將各對照品的儲備液各取適量后，置10 mL容量瓶中，混勻，并用甲醇定容置刻度，混勻后得混合對照品的儲備液。所有的對照品溶液均儲存在4 ℃。

2.4 樣品測定

分別精密稱取表1中的各份樣品約0.5 g，按照2.2項下供試品溶液的制備方法進行處理，按照2.1項下所建立的分析方法進行測定，計算各樣品中測得成分的含量，含量測定結果見表2。

表1 32批黃芩樣品采集信息

2.5 黃芩藥材中主要黃酮類化合物的含量比較

采于河北省承德縣與山西省的共32批黃芩藥材樣品中，經與各標準品比對共指認9個黃酮類化合物，其他化合物未檢出(黃芩藥材代表性樣品與標準品色譜圖見圖1)，該9個黃酮類化合物含量測定結果見表2。結果表明不同產區黃芩藥材9個黃酮類化合物的含量差別較大，各黃酮的質量分數范圍分別為：0.79～5.68 mg·g-1(1)、2.84～14.43 mg·g-1(3)、69.73～147.18 mg·g-1(5)、8.54～35.54 mg·g-1(8)、0.27～2.55 mg·g-1(9)、1.1～18.3 mg·g-1(11)、0.75～7.08 mg·g-1(12)、0.04～1.32 mg·g-1(13)、0.09～2.14 mg·g-1(14)。化合物含量高低順序依次為黃芩苷(5)>漢黃芩苷(8)>黃芩素(11)>野黃芩苷(3)>漢黃芩素(12)>異紅花素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(1)>千層紙素A(14)>白楊素(13)。

注：1.異紅花素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷；2.紅花素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷；3.野黃芩苷；4.芹菜素-7-O-β-D-葡萄苷；5.黃芩苷；6.白楊素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷；7.木犀草素；8.漢黃芩苷；9.山姜素；10.芹菜素；11.黃芩素；12.漢黃芩素；13.白楊素；14.千層紙素A。圖1 黃芩代表性樣品(A)與對照品(B)疊加譜圖

表2 32批黃芩藥材樣品中主要黃酮類化合物含量測定結果 mg·g-1

續表2

2.5.1 河北產區與山西產區黃芩藥材的黃酮含量對比分析 對實驗數據進一步進行統計，分析了不同產區、生長年限、采收季節這些因素對黃酮類化合物含量的影響，不同產區黃芩藥材的黃酮含量對比分析結果見表3。該統計學分析結果表明，河北產區和山西產區黃芩藥材中所測得的野黃芩苷與千層紙素A的含量在兩個地區間存在顯著差異。另外，兩地區測定的黃酮總含量不存在顯著性差異。說明兩地黃芩藥材測定的黃酮總含量存在一定的一致性，但從單體黃酮類化合物含量角度出發，兩地黃芩藥材質量卻存在一定的差異性。

表3 不同產區黃芩藥材中主要黃酮類化合物含量對比分析 mg·g-1

注：采用Duncan’s multiple range test方差分析，同一列同一濃度不同字母代表在P<0.05水平差異具有統計學意義。

2.5.2 不同生長年限黃芩藥材的黃酮含量對比分析 不同生長年限黃芩藥材的黃酮含量測定結果見表4，3年生黃芩藥材的黃芩苷、漢黃芩苷含量較高，且與其他年限生長黃芩藥材間存在顯著性差異；不同生長年限黃芩藥材中黃酮類化合物：異紅花素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、山姜素、白楊素、千層紙素A的含量無顯著性差異；3年生黃芩藥材的野黃芩苷含量與2年和7年生的黃芩藥材存在顯著差異，而與1年生黃芩藥材中的含量相近，無顯著差異；7年生黃芩素和漢黃芩苷的含量與其他生長年限的黃芩藥材，含量較高且存在顯著差異。化合物異紅花素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、山姜素、黃芩素、千層紙素A的含量，3年生>2年生>1年生，隨著年限的延長含量呈上升趨勢。測定的各黃酮總含量，3年生黃芩藥材最高，1年生與2年生黃芩藥材總量相近。

2.5.3 不同采收期黃芩藥材的黃酮含量對比分析 不同采收時期黃芩藥材的黃酮含量測定結果見表5，結果顯示化合物野黃芩苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素的含量在春季和采收的黃芩根部中有顯著性差異，其在春季采收時含量更高。其他5種黃酮類化合物在不同采收期黃芩藥材中的含量相近，無顯著性差異。春季采收的測得各黃酮總含量與秋季的存在顯著性差異，且前者高于后者。

表4 不同生長年限黃芩藥材的黃酮含量測定結果 mg·g-1

注：采用Duncan’s multiple range test方差分析，同一列同一濃度不同字母代表在P<0.05水平差異具有統計學意義。

表5 不同采收時期黃芩藥材的黃酮含量測定結果 mg·g-1

注：采用Duncan’s multiple range test方差分析，同一列同一濃度不同字母代表在P<0.05水平差異具有統計學意義。

3 討論

3.1 黃芩藥材樣品的采集

黃芩藥材樣品的采集地點的選擇合適：產于河北省承德市的熱河黃芩是目前普遍認為的道地藥材，在20世紀30年代，《藥物出產辨》已有記載“直隸、熱河一帶均有出”，而山西雖為非道地黃芩產區，卻為2～3年生黃芩藥材的主產區[16]；本研究黃芩樣品采集較為全面和典型：黃芩道地藥材樣品收集全面，系統性的收集了河北省承德市各縣的黃芩藥材。非道地產區山西則主要采集產量較大的晉中與晉南地區的黃芩藥材樣品。

3.2 測定結果分析

本課題組利用建立的測定黃芩植物主要黃酮類化合物的HPLC方法，測定了河北與山西不同產地、不同年限、不同采收季節的黃芩藥材的9個黃酮類化合物的含量，并系統地分析了彼此間的差異性。河北省承德市與山西產區的黃芩藥材中野黃芩苷和千層紙素A的含量存在顯著性差異。另外，綜合兩個產地測定結果發現，不同生長年限的黃芩藥材中黃酮類化合物的含量存在一定的差異性，其中3年生黃芩藥材的黃芩苷、漢黃芩苷含量較高，與1年生、2年生和7年生的黃芩存在顯著性差異。根據測得黃酮類化合物的總含量結果，發現3年生>7年生>1年生和2年生，3年生的黃芩藥材品質較好，但在黃芩藥材產區卻以2～3年生黃芩為主，推測因考慮到經濟效益和產量，為在保證質量的基礎上，大多產區選擇種植2～3年生的黃芩。對河北省承德地區不同采收季節黃芩藥材黃酮類化合物的含量測定結果顯示，春季采收的黃芩根部中野黃芩苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素的含量高于秋季采收的黃芩，春季采收的黃芩藥材各黃酮總含量也高于秋季采收黃芩，春季采收的黃芩藥材質量較優，這可為黃芩藥材的采收季節提供一定的參考。

據2015版《中華人民共和國藥典》規定的黃芩藥材按干燥品計算，含黃芩苷不得少于9.0%，但在本研究中發現，若以黃芩苷含量多少為標準評判藥材質量的優劣，不論在黃芩藥材傳統道地產區河北省承德市還是非道地產區山西省，都存在一些樣品不合格的現象，這雖從側面反映了黃芩藥材存在的質量不均一的情況，但以單一成分評價藥材質量是否合理需要進一步的深入研究。因此為保證藥材品質，需要規范黃芩種植，確定黃芩藥材的最佳采收年限和采收期，也需要更科學的方法評價黃芩藥材的品質，本實驗為此提供了一定的參考和科學依據。