腦心通膠囊腸吸收液清除DPPH自由基的有效成分辨識研究△

郭宇飛，趙曄，何子龍，方文娟，吳宏偉，楊洪軍，張方博

中國中醫科學院 中藥研究所，北京 100700

中藥復方的復雜性是中藥復方研究的重點和難點，包括組成的復雜、成分的復雜以及作用機制的復雜，因此解析中藥復方的復雜性，成為亟待解決的科學難題。中藥復方的拆方研究是指把方劑中的藥物逐步減去一味或幾味中藥，以考察其療效的變化，或者進一步尋找有效成分[1]。真武湯的拆方研究結果表明，其強心作用的主要藥物是附子，但附子的毒性也較強，當與方中其他藥物配伍后，如與生姜配伍，既增強全方的強心利尿作用，又降低毒性[2]。拆方研究在中藥復方組方理論研究中廣泛使用。

腦心通膠囊由黃芪、當歸、全蝎、赤芍、丹參、沒藥(制)、桂枝、桑枝、地龍、川芎、桃仁、乳香(制)、雞血藤、紅花、牛膝、水蛭等16味藥組成[3]，具有化瘀通絡、益氣活血之功效，臨床用于治療脈絡瘀阻、氣虛血滯所導致的中風中經絡、口眼歪斜、肢體麻木、舌強語謇及胸痹心悸等[4]。研究表明益氣活血方(法)通過增強心肌細胞線粒體中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)的活性，降低丙二醛(MDA)含量，有效抑制氧自由基引發的損傷，降低細胞膜通透性，減少心肌細胞肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)的釋放，起到心肌保護作用[5-6]。

自由基(Free Radical)是指外層軌道含有未配對電子的原子、原子團或特殊狀態的分子，主要包括氧自由基、羥自由基、過氧自由基和氮氧自由基等。自由基參與機體多種生理活動，病理狀態下過量產生的自由基可破壞組織，并造成功能損傷。研究報道自由基與動脈粥樣硬化、心肌缺血再灌注損傷、心律失常、充血性心力衰竭等心血管疾病的發生發展有密切關系[7]。臨床急性冠脈綜合征病人血漿抗氧化能力減弱，血漿丙二醛(MDA)水平升高，其活性可作為判斷疾病嚴重程度和預后的標準[8]。黃嘌呤氧化酶活力增高可引起超氧陰離子自由基產生增多，造成心肌細胞膜結構和功能的破壞，膜液態性、流動性及通透性改變，使用黃嘌呤氧化酶抑制劑可緩解心衰病人的癥狀[9]。

鑒于前期研究已建立過氧化氫損傷大鼠胚胎心肌細胞株(H9c2)模型，結果表明腦心通膠囊腸吸收液具有抗氧化作用，如升高總抗氧化能力(T-AOC)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)和過氧化氫酶(CAT)的水平，降低MDA和ROS的水平[10]。1，1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)自由基清除實驗為體外評價藥物抗氧化活性的簡易方法。DPPH是以氮為中心的穩定自由基，常用于體外評價物質的抗氧化活性。若受試物能清除DPPH，則受試物可能具有降低羥自由基、烷自由基、過氧自由基和打斷脂質過氧化鏈反應的抗氧化作用[11]。

本課題組以腦心通膠囊為研究對象，采用“腸吸收-體外活性”結合拆方重組模式對腦心通膠囊清除DPPH自由基的抗氧化作用進行初步解析，試從復方整體和單味藥兩個方面揭示腦心通膠囊各組成中藥發揮藥效的比重，再通過高活性藥物的重組和去除進行活性確證。

1 材料與儀器

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠，體質量(230±20)g，購于軍事醫學科學院實驗動物中心，許可證號：SCXK-(Jun)2012-0004。

1.2 藥物及試劑

腦心通膠囊及黃芪、赤芍、全蝎、水蛭、紅花、丹參、雞血藤、川芎、當歸、桃仁、牛膝、桑枝、桂枝、乳香(制)、沒藥(制)和地龍等16味藥超微粉末由陜西步長制藥有限公司提供；95%乙醇、葡萄糖、氯化鉀、磷酸二氫鈉、氯化鈉、氯化鎂、碳酸氫鈉和氯化鈣均為國產分析純；DPPH(東京化成工業株式會社)。

1.3 儀器

BP110S型電子分析天平(Sartorius)；SpectraMax M5多功能酶標儀(Molecular Devices)；旋轉蒸發器(EYELA SB-1100)；循環水真空泵SHZ-DⅢ(鞏義予華儀器有限責任公司)；ALC-M型組織-器官水浴系統(上海奧爾科特生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 腸吸收液制備

稱取腦心通膠囊粉末50 g，加入95%乙醇1000 mL，回流提取2 h，抽濾，濾液旋轉蒸發至干。按照4 g/25 mL原藥材的比例加入Tyrode緩沖液(NaCl 8.00 g，KCl 0.28 g，NaHCO31.00 g，NaH2PO40.05 g，MgCl20.10 g，CaCl20.20 g，葡萄糖 1.00 g，pH 7.4)，超聲復溶，提取物全部溶解，得到分散均一的混懸液，即制作腸吸收液的供試液。大鼠實驗前禁食12 h，頸部脫臼處死，沿腹中線剪開皮膚，然后沿腹白線剪開肌肉。找出胃幽門，自幽門以下10 cm開始截取腸段并沖洗干凈。將硅膠套管的一端插入腸管中，將腸道內表面翻轉，用細線結扎；然后用0 ℃ Tyrode緩沖液沖洗腸段內表面，將另一端用線結扎，確保不漏液。量取25 mL腦心通膠囊供試液(或加入Tyrode緩沖液，為空白腸吸收液)，預先將其加入麥氏浴管中，同時通入95% O2和5% CO2的混合氣體，開啟37 ℃恒溫水浴循環系統。用注射器吸取2 mL Tyrode緩沖液，注入腸管中，然后將其置于麥氏浴管中。2 h后收集腸管內液體，0.22 μm無菌濾膜過濾分裝，-20 ℃保存待用。

2.2 DPPH氧自由基清除

吸取待測液50 μL于96孔板，加入150 μL的DPPH溶液，混勻后避光靜置30 min，以空白腸吸收液為空白對照，在517 nm處測定吸光度值(A1)；同時測定上述待測液50 μL與150 μL 80%乙醇混合后517 nm的吸光度值(A2)；再測定50 μL Tyrode緩沖液與150 μL DPPH溶液混合后517 nm的吸光度值(A3)。每個樣品設3個復孔，實驗重復3次，按公式(1)計算清除率。

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100%

2.3 數據處理

3 結果

3.1 腦心通膠囊及14個單味藥的DPPH自由基清除作用

由于乳香及沒藥為樹脂類藥物，兩者醇提取物不溶于Tyrode緩沖液，無法制備腸吸收液，其余14種單味藥按前述方法制備出相應的腸吸收液，生藥量及稀釋起始質量濃度見表1。結果顯示腦心通膠囊腸吸收液能清除DPPH自由基，呈劑量依賴性(見圖1)。14味單藥均表現出清除DPPH自由基的作用，呈劑量依賴性。稀釋4或8倍質量濃度時(即250或125 μg·mL-1)，桃仁、桂枝、紅花、雞血藤、川芎、當歸、桑枝、地龍、全蝎、水蛭的自由基清除率明顯低于腦心通膠囊組，牛膝的自由基清除率與腦心通膠囊組比較，差異無統計學意義，丹參、黃芪、赤芍的自由基清除率顯著高于腦心通膠囊組(P<0.05)(見圖2)。單味藥質量濃度與其在腦心通膠囊原方中的質量濃度相同時，丹參、黃芪、赤芍的自由基清除率與腦心通膠囊組的差異無統計學意義，其他各組均顯著降低(見圖3)。聚類分析結果表明14味單藥被分為兩類：第一類為丹參、黃芪和赤芍；第二類為剩余11味藥(見圖4)。

表1 腦心通膠囊全方以及各單味藥腸吸收液相關質量濃度 μg·mL-1

3.2 重組復方的DPPH自由基清除作用

將丹參、黃芪和赤芍組成三味復方，去除丹參、黃芪和赤芍重組成去三味復方，將以上復方制備成相應的腸吸收液，與腦心通膠囊腸吸收液對比，觀察這3組的DPPH自由基清除作用。兩組藥物各藥稱量與全方比例相同，制備過程與全方腸吸收液制備過程相同，三味復方生藥質量濃度為0.3 mg·mL-1，稀釋4倍時作用質量濃度為75 μg·mL-1；去三味復方生藥質量濃度為0.7 mg·mL-1，稀釋4倍時作用質量濃度為175 μg·mL-1；腦心通膠囊生藥質量濃度為1.0 mg·mL-1，稀釋4倍時作用濃度為250 μg·mL-1。結果表明3種組合復方均具有顯著的DPPH自由基清除作用。與腦心通膠囊腸吸收液的自由基清除作用相比較，三味復方自由基清除作用最強，腦心通膠囊其次，去三味復方最弱(見圖5)。將丹參、黃芪和赤芍各單味藥制成腸吸收液，與三味復方腸吸收液(75 μg·mL-1)、腦心通膠囊腸吸收液(247 μg·mL-1)對比，并使單味藥質量濃度與其在全方中的質量濃度相同(見表1)，觀察這5組腸吸收液的DPPH自由基清除作用，結果表明腦心通膠囊自由基清除作用最佳(見圖6)。

注：與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01。圖1 不同稀釋倍數腦心通膠囊腸吸收液對DPPH自由基清除的影響

注：與腦心通膠囊組相比，*P<0.05。圖2 不同稀釋倍數腦心通膠囊以及14味單藥對DPPH自由基清除的影響

圖3 單味藥和腦心通膠囊原方等質量濃度時DPPH自由基的清除率比較

注：14味單藥被分為兩類：第一類為丹參、黃芪、赤芍；第二類為剩余11味。1～15分別代表桑枝、雞血藤、川芎、當歸、紅花、桃仁、牛膝、赤芍、黃芪、地龍、水蛭、丹參、全蝎、桂枝和腦心通膠囊。圖4 聚類分析14味單藥對DPPH自由基的清除作用

注：與腦心通膠囊組相比，*P<0.05。圖5 三味復方、去三味復方以及腦心通膠囊對DPPH自由基的清除作用

圖6 各組質量濃度相同時對DPPH自由基的清除作用

4 討論

腸囊外翻技術是相對比較成熟穩定的體外腸吸收模型，已廣泛用于藥物吸收和代謝等研究中。近年來也開始應用于中藥有效成分辨識的研究，例如腸囊外翻技術應用于車前子的吸收成分群和藥效成分群的快速發現[12]；應用此方法使用大鼠不同腸段對養血清腦顆粒中芍藥苷和阿魏酸的吸收動力學特征進行研究[13]。本課題組利用腸囊外翻法制備元胡止痛方的腸吸收液，研究其對離體血管舒張活性的影響[14-15]，并應用腦心通膠囊腸吸收液研究心肌細胞保護作用等[10]。疏風解毒膠囊腸吸收液能抑制LPS誘導巨噬細胞釋放多種細胞因子[16]。本研究的腸吸收液的制備，使用Tyrode緩沖液復溶提取物，使腸吸收液中以水溶性成分居多，更適合于以水溶性成分為主的中藥。與血清藥理學相比較，腸吸收液的成分多，含藥量較高而干擾性成分少，活性顯著。此法操作簡單、重復性好，是中藥有效成分辨識和機制研究的有效手段。

氧化應激在多數心血管疾病的病理生理發展過程中發揮重要作用，氧化應激過程中，體內氧化和抗氧化失衡，大量氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)生成和堆積過多，伴或不伴抗氧化能力下降，引起細胞化學損害，功能障礙，導致心肌細胞凋亡甚至壞死[17-18]。DPPH自由基是人工合成的、穩定的有機自由基，常用來體外評價和篩選抗氧化活性，此法具有穩定性好、靈敏度高、操作簡便等優點。DPPH清除能力與心血管疾病密切相關，可體外評價和篩選抗心血管疾病藥物的藥效[19]。與健康男性相比較，冠心病男性病人血清DPPH清除能力明顯下降[20-21]。同時，若健康男性血清DPPH清除能力下降，其罹患冠心病的風險增加[21]。本實驗通過觀察腦心通膠囊全方、單味藥以及重組方腸吸收液清除DPPH自由基的影響，不同于體內病理生理過程產生的自由基，只是作為抗氧化作用的其余補充，初步評價其心血管保護作用。

實驗結果表明14個單味藥清除DPPH自由基的強度各不相同，稀釋等倍質量濃度(4倍)時，黃芪、丹參和赤芍的抗氧化作用顯著高于腦心通膠囊組，桃仁無明顯抗氧化作用，其他10味藥均有一定的抗氧化作用，但明顯低于腦心通膠囊組。因此黃芪、丹參和赤芍可能是腦心通膠囊發揮抗氧化作用的主要參與者。為確證此假設，根據聚類分析結果將丹參、黃芪和赤芍組合成三味復方，同時從腦心通膠囊原方中去除上述三味藥，重組成去三味復方，均按腦心通膠囊原方配比組合，通過提取制備腸吸收液，進行抗氧化活性再評價。結果顯示，三味復方組仍具有較強的抗氧化活性，而去三味組方的抗氧化活性顯著降低，進一步說明腦心通膠囊中丹參、黃芪、赤芍發揮著主要抗氧化作用。然而，單味藥的質量濃度在單味藥組、三味復方組及腦心通膠囊組中的質量濃度相同時，三味復方組活性顯著低于腦心通膠囊組，與三味藥單獨作用比較，也明顯下降。由此推測丹參、黃芪和赤芍是腦心通膠囊抗氧化作用的主要活性成分，但其抗氧化作用仍是全方綜合的作用結果，其作用機制有待深入研究。

丹參為中藥活血化瘀常用藥，現代藥理研究表明丹參可減少或清除自由基，抑制過氧化反應，打斷級聯反應[22]。在腦心通膠囊腸吸收液中檢測到來自丹參的成分僅有丹參素、迷迭香酸、丹酚酸B和丹參酮I 4種成分，其中只有迷迭香酸和丹酚酸B具有明確的抗氧化作用，因此迷迭香酸和丹酚酸B可能為腦心通膠囊抗氧化作用的有效成分。

黃芪中的黃芪總黃酮、黃芪總皂苷、黃芪總多糖都具有清除氧自由基的作用，腦心通膠囊腸吸收液中可檢測到來自黃芪的成分包括芒柄花苷、綠原酸、毛蕊異黃酮苷、黃芩苷、香豆精、刺芒柄花素、黃芪甲苷等，而芒柄花苷的抗氧化作用遠小于毛蕊異黃酮苷[23]。綠原酸、毛蕊異黃酮苷、黃芩苷、黃芪甲苷具有較強的抗氧化作用，可能為腦心通膠囊抗氧化作用的主要有效成分。

赤芍中發揮抗氧化作用的成分主要為沒食子酸芍藥苷、沒食子酸、沒食子酸氧化芍藥苷及兒茶精[24]。腦心通腸吸收液中來自赤芍的成分包括芍藥苷、芍藥內酯苷、沒食子酰芍藥苷、沒食子酸，因此，腦心通膠囊中沒食子酸可能是腦心通膠囊抗氧化作用的主要有效成分。

綜上，本研究從體外DPPH自由基清除實驗來評價腦心通膠囊的抗氧化作用，DPPH為人工合成的自由基，不同于機體病理生理過程產生的多種自由基，且抗氧化作用僅為心血管疾病眾多分子發病機制之一，因此本實驗無法模擬和重現在體的病理過程，具有一定的不足性和局限性。丹參、黃芪、赤芍單獨作用時雖表現出顯著的抗氧化活性，但三味藥組合時，抗氧化作用弱于腦心通膠囊全方，因此腦心通膠囊的抗氧化作用是全方綜合作用的結果，但主要發揮抗氧化作用的仍是黃芪、丹參、赤芍。通過全方、拆方以及重組方結合腸吸收液模式研究中藥復方體外活性，辨識發揮主要藥效的成分，為中藥復方體外給藥以及活性研究提供新的研究方法和思路。