龜鹿二仙口服液質量標準研究△

史兆松，馬棟棟，張淹，李士棟，周祥山

1.東阿阿膠股份有限公司/國家膠類中藥工程技術研究中心/山東省膠類中藥研究與開發重點實驗室，山東 聊城 252201； 2.華潤昂德生物藥業有限公司，山東 聊城 252201

龜鹿二仙口服液由龜甲、鹿角、黨參、枸杞子4味中藥材組成。具有溫腎益精的功效，臨床上主要用于久病腎虛，腰酸膝軟和遺精陽痿等。該產品質量標準中缺少鑒別和含量測定方法，為更好地控制產品質量，保證臨床用藥安全有效，對質量標準開展再提升研究。分別對龜甲、鹿角、黨參、枸杞子四味中藥材進行薄層色譜鑒別，對甜菜堿進行含量測定，為產品的質量控制提供數據參考。

1 材料

1.1 儀器

Ultimate3000型高效液相色譜儀(Dionex)，UltiMate3000系列光電二極管陣列檢測器，色譜柱為丙基酰胺鍵合硅膠為填充劑(150 mm×4.6 mm，5 μm)；BS224S型電子天平(賽多利斯)；C9960A型超聲清洗儀(CBL Photoelectron Technology)；薄層攝像儀(瑞士CAMAG公司)；Mili-Qpius型超純水制備儀(密理博公司)；硅膠G薄層板(青島海洋化工廠)。

1.2 試藥

甘氨酸、甜菜堿、黨參對照藥材、枸杞子對照藥材(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為：110735-200102、110894-200503、121057-201206、121072-201109)；各陰性對照樣品均為自制；乙腈、甲醇均為色譜純；水為純化水，其余試劑均為分析純。

龜鹿二仙口服液產自東阿阿膠股份有限公司，批號分別為：20140601、20140602、20140603、20140801、20150101、20150102、20150103、20150401、20150402、20150403。

2 薄層色譜鑒別

2.1 甘氨酸鑒別

取本品1 mL，置具塞試管中，加水2 mL，鹽酸2 mL，密塞，置105 ℃干燥箱中加熱6 h，取出，加水6 mL搖勻，濾液蒸干，殘渣加10%乙醇10 mL使溶解，作為供試品溶液；取缺龜甲、鹿角的陰性樣品同法制成陰性樣品溶液。另取甘氨酸對照品，加10%乙醇溶解，制成質量濃度為1 mg·mL-1的溶液，作為對照品溶液。吸取供試品溶液及陰性對照溶液各2 μL、對照品溶液1 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，展開劑：苯酚-0.5%硼砂水溶液(4∶1)，展開，取出，晾干，置105 ℃干燥箱中加熱10 min，取出，立即噴以2%茚三酮乙醇溶液，至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。陰性對照色譜中無相應斑點，見圖1。

注：1.甘氨酸；2～4.樣品；5.陰性樣品。圖1 甘氨酸薄層色譜圖

2.2 黨參鑒別

取本品60 mL，加水飽和的正丁醇振搖提取3次(40、40、30 mL)，合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌2次，每次20 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取缺黨參的陰性樣品同法制成陰性樣品溶液。另取黨參對照藥材4 g，分別加水30 mL煎煮兩次，每次30 min，合并煎液，濾過，濾液同法制成黨參對照藥材溶液。吸取上述3種溶液各20 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，展開劑：甲苯-乙酸乙酯-甲酸(15∶2∶2)，展開，取出，晾干，噴以硫酸-乙醇(1∶1)，置105 ℃干燥箱中加熱約7 min，置紫外光燈(365 nm)下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。陰性對照色譜中無相應斑點，見圖2。

注：1.黨參對照藥材；2～4.樣品；5.陰性樣品。圖2 黨參薄層色譜圖

2.3 枸杞子鑒別

取2.2項下制備的供試品溶液。取缺枸杞子的陰性樣品和枸杞子對照藥材2 g，同2.2項方法制成陰性樣品和對照藥材溶液。點樣、展開、顯色等操作同2.2項下方法。結果見圖3。

注：1.枸杞子對照藥材；2～4.樣品；5.陰性樣品。圖3 枸杞子薄層色譜圖

3 含量測定

3.1 色譜條件與系統適用性試驗

采用HILIC(丙基酰胺鍵合硅膠)色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈-水(80∶20)為流動相；柱溫為30 ℃；蒸發光散射檢測器檢測漂移管溫度為98 ℃；體積流速為0.8 mL·min-1。

3.2 甜菜堿對照品溶液

精密稱取甜菜堿，加水溶解制成質量濃度為0.5 mg·mL-1的溶液，即得。

3.3 供試品溶液制備

精密吸取本品20 mL，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇40 mL，密塞，稱定質量，超聲處理(功率：800 W，頻率：40 kHz)30 min，放冷，再稱定質量，用80%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，先上預處理的陰離子樹脂柱(內徑為1.5 cm，柱高為15 cm)，用40 mL水洗脫，收集洗脫液，后上預處理的陽離子樹脂柱(內徑為1.5 cm，柱高為15 cm)，用40 mL水洗脫至無色，棄去洗脫液，再用15%氨水溶液40 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加適量水溶解，轉移至10 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

3.4 陰性樣品溶液制備

精密吸取缺枸杞子的陰性樣品20 mL，同3.3項方法制成。

3.5 專屬性試驗

分別精密吸取上述3種溶液各5 μL，按照3.1項下色譜條件進行測定。結果表明，陰性對照無干擾，見圖4。理論板數按甜菜堿峰計算應不低于4000。

3.6 檢測限及定量限

將甜菜堿對照品色譜峰測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較，分別以信噪比為3∶1及10∶1時注入液相色譜儀的量確定檢測限與定量限，檢測限為0.68 ng，定量限為2.40 ng。

3.7 線性關系考察

精密稱取甜菜堿4.12 mg，置10 mL量瓶中，加水溶液至刻度，搖勻。分別吸取2.5、5、7.5、10、12.5、15 μL，按照3.1色譜條件依次進樣，測定峰面積。以對照品的濃度為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，得回歸方程：Y=30.828X+23.654，r=0.999 9。甜菜堿在1.03～6.18 μg呈良好線性關系。

注：A.對照品；B.供試品；C.陰性對照樣品。圖4 甜菜堿HPLC圖

3.8 精密度試驗

取3.2項下對照品溶液，重復進樣6次，每次10 μL，按照3.1色譜條件測定峰面積，計算RSD為1.47%(n=6)，結果表明儀器精密度良好。

3.9 穩定性試驗

精密量取本品(批號：20140801)20 mL，按照3.3項方法制備，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣6次，每次進樣5 μL，測得峰面積，計算RSD為2.38%，結果表明，供試品溶液在24 h內穩定性良好。

3.10 重復性試驗

精密量取本品(批號：20140801)6份，按照3.3項方法平行制備，按照3.1項色譜條件，分別進樣5 μL測定，甜菜堿平均含量為0.226 mg·mL-1，RSD為1.07%(n=6)，結果表明重復性良好，方法可行。

3.11 加樣回收率試驗

精密量取質量濃度為0.225 5 mg·mL-1的甜菜堿樣品(批號：20140801)共6份，每份10 mL，分別精密加入甜菜堿對照品溶液(質量濃度為0.488 mg·mL-1)各6 mL，再加水至20 mL，制備6份供試品溶液，按照3.1項色譜條件，分別進樣5 μL測定，計算回收率及RSD，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果(n=6)

3.12 耐用性試驗

取本品按照3.1項下方法試驗，因甜菜堿為水溶性生物堿成分，很難在C18柱上有所保留，并且無特異的紫外吸收，故確定選用HILIC色譜柱按照3.1項下的色譜條件對其進行測定，含量測定結果無明顯差別。

3.13 樣品測定

精密量取10批龜鹿二仙口服液樣品(批號分別為：20140601、20140602、20140603、20140801、20150101、20150102、20150103、20150401、20150402、20150403)，按照3.3項下方法制備供試品溶液，按照3.1項色譜條件，分別進樣5 μL測定，結果見表2。

表2 樣品測定結果(n=10)

4 討論

龜鹿二仙口服液是由龜甲、鹿角、黨參、枸杞子4味中藥材組成的中藥復方制劑，本研究通過色譜分離技術對處方中主要成分進行定性、定量分析。進一步提升了龜鹿二仙口服液質控水平，由于處方中成分復雜，分離困難、干擾多，通過上陰、陽離子樹脂柱進行洗脫，除去氨基酸、蛋白質、多糖等成分，達到純化供試品溶液的目的，使含量測定結果準確可靠。

原標準中僅采用定氮法測總氮量，專屬性不強、產品質量標準較低。通過對處方成分分析，對產品中枸杞子有效成分之一甜菜堿進行研究，建立了HPLC含量測定方法。甜菜堿系甘氨酸的三甲基衍生物，季胺型水溶性生物堿，基本結構為(CH3)3-N+-CH2-COO-，分子式為C5Hl1N02，分子質量為117.11，無共軛結構。純化方法曾采用0.1 mol·L-1異硫氰酸苯酯(PITC)乙腈溶液及1 mol·L-1三乙胺的乙腈溶液衍生后測定，發現衍生后未檢測出理想甜菜堿成分峰；樣品采用單陽離子柱洗脫后，測得成分峰很多且有重疊，甜菜堿成分分離度不理想。供試品選用上陰、陽離子柱洗脫處理后，雜質成分較少，沒有出現干擾峰，且甜菜堿成分峰分離度較好。

本文對處方中全部藥味均進行了薄層鑒別，在甘氨酸鑒別中，最初采用正丁醇-乙酸-水(3∶1∶1)為展開劑，但存在拖尾及背景干擾等缺點，經摸索，以苯酚-0.5%硼砂水溶液(4∶1)為展開劑時，分離度較好，展開效果理想，且在105 ℃加熱10 min再噴顯色劑比晾干后顯色要好；在顯色劑方面，2%茚三酮乙醇溶液比0.2%茚三酮乙醇溶液效果更明顯。對黨參、枸杞子鑒別中，分別選擇各自對照藥材作對照，在本實驗選擇確定的薄層色譜條件下，斑點清晰，分離度好，陰性對照無干擾。

龜鹿二仙口服液選取甜菜堿作為控制制劑質量的首選目標，根據《中華人民共和國藥典》2015年版規定[1]，枸杞子藥材按干燥品計算，含甜菜堿不得少于0.30%，依據龜鹿二仙口服液處方，建議含量測定限度為不得少于0.15 mg·mL-1。