光滑念珠菌MSH2基因突變與氟康唑耐藥的研究

劉赟蕾，宮婷婷，王中新

近年來，侵襲性光滑念珠菌感染發病率不斷上升，光滑念珠菌對常規抗真菌藥物的耐藥情況愈加嚴重，且多重耐藥光滑念珠菌檢出率也明顯升高，給臨床抗真菌感染治療帶來巨大挑戰。研究[1]表明，真菌耐藥性的產生歸因于基因突變，從點突變到整個染色體缺失、插入、重排等。DNA錯配修復(mismatch repair,MMR)系統維持DNA復制的保真性，其廣泛存在于生物體中，該系統缺陷與基因突變率增加有關[2]。在人類基因組中，該系統缺陷與某些癌癥(如非息肉型結直腸癌)相關[2-3]；在細菌中，MMR系統缺陷是細菌獲得性耐藥性的重要機制[4]；在白色念珠菌中，MMR系統缺陷導致基因不穩定性增加，更快獲得對氟康唑耐藥性[5]。MSH2基因為核MMR基因(屬MMR系統基因的一種)，相關研究[1]表明MSH2基因突變為光滑念珠菌獲得多重耐藥性的驅動因素，且具有特定錯義突變的菌株在體外表現出更高的耐藥性。該實驗通過分析氟康唑敏感型、劑量依賴性敏感型(susceptible-dose dependent,S-DD)及耐藥型光滑念株菌中MSH2基因突變情況，旨在探討光滑念珠菌MSH2基因突變與氟康唑耐藥的關系。

1 材料與方法

1.1 菌株來源收集安徽醫科大學第一附屬醫院檢驗科2017年7月～2018年7月的門診及住院患者的痰、尿、血液或分泌物等標本中分離獲得的光滑念珠菌，標本源自同一患者同一住院時間段同一部位的重復菌株只納入一株分析，菌株保存在-80 ℃菌株庫。選取光滑念珠菌ATCC MYA-2950作為真菌鑒定的質控菌株，白色念珠菌ATCC 10231作為真菌藥敏的質控菌株，使用大腸桿菌ATCC 8739作為質譜儀器的校準菌株。

1.2 儀器和試劑酵母基因組DNA提取試劑盒(上海生工生物工程有限公司)；DL 5 000 DNA Marker 和Premix Ex Taq 酶體系(日本TaKaRa公司)；RPMI1640液體培養基(美國GIBCO公司)；MOPS(北京索萊寶技術有限公司)；ATBFUNGUS3試劑盒、VITEK MS IVD (V2.0) 質譜儀 (法國Biomérieux公司)；PCR儀(德國 Biometra公司)；電泳儀(北京六一儀器廠)；全自動凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)等。

1.3 方法

1.3.1菌株鑒定 將菌株從-80 ℃菌株庫中取出，接種于科瑪嘉念珠菌顯色培養基，35 ℃培養48 h初步鑒定，再用VITEK MS IVD (V2.0) 質譜儀進一步鑒定，以光滑念珠菌ATCC MYA-2950作為鑒定質控菌株，質譜儀器的校準菌株大腸桿菌ATCC8739。

1.3.2藥敏試驗 采用ATBFUNGUS3試劑盒進行體外藥敏試驗，藥敏結果根據美國臨床和實驗室標準協會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推薦折點判讀，以白色念珠菌ATCC 10231作為真菌藥敏的質控菌株，隨機選取19株氟康唑耐藥菌株、15株氟康唑中介菌株和23株敏感菌株，-80 ℃保存備用。

1.3.3制備DNA模板 將上述菌株從-80 ℃菌株庫中取出，接種于沙保弱培養基35 ℃培養48 h傳代2次進行復蘇，挑取單個菌落于5 ml RPMI1640液體培養基，37 ℃、250 r/min震蕩培養16 h。取1 ml菌液離心收集菌體，按照酵母基因組DNA提取試劑盒說明書操作提取DNA，產物放于-20 ℃冰箱備用。

1.3.4擴增MSH2基因及測序MSH2基因引物設計參照已有文獻[6]委托上海生工生物工程有限公司合成，使用3對引物33F/1188R、1013F/2170R、1914F/2985R 對MSH2基因分段擴增，所得產物分別標記為MSH2基因片段1、MSH2基因片段2、MSH2基因片段3，引物序列見表1。50 μl PCR反應體系為5×PrimeSTAR GXL Buffer 10 μl，PrimeSTAR GXLDNAPolymerase 1 μl，dNTPMixture(各2.5 mmol/L ) 4 μl，上下游引物(10 μmol/L)各1 μl，DNA模板(25 ng/μl)2 μl，滅菌雙蒸水31 μl。PCR反應條件為95 ℃預變性10 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環35次，最后72 ℃延伸7 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，采用全自動凝膠成像儀中觀察拍照。將PCR產物送至上海生工公司測序，測序結果應用BLST軟件，與標準序列(KY110695.1-KY110696.1)進行比對分析。

表1 MSH2基因PCR引物序列

1.4 統計學處理應用SPSS 17.0軟件進行分析，3組實驗菌株出現MSH2基因突變頻率比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義；3組之間的兩兩比較以P<0.016 7為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 光滑念珠菌藥敏試驗結果經鑒定，共157株光滑念珠菌，對氟康唑等5種抗真菌藥物的藥敏分析結果見表2，同時存在唑類交叉耐藥及多藥耐藥現象。

表2 157株光滑念珠菌體外藥敏結果情況(%)

2.2MSH2基因PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果以隨機選取的57株研究菌株的DNA為模板，對MSH2基因分段行PCR擴增，每株均獲得預期大小的片段。部分菌株PCR產物電泳結果見圖1。

圖1 MSH2基因分段PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果

A:MSH2基因片段1；B:MSH2基因片段2；C:MSH2基因片段3；M：DNA Marker；P:陽性對照(已經實驗室檢測確認為光滑念珠菌MSH2基因的DNA)；N:陰性對照；1～4：部分氟康唑耐藥菌株；9～12：部分S-DD菌株；17～20：部分敏感菌株

2.3MSH2基因測序結果目的基因測序結果與Genbank中MSH2基因標準序列進行Blast分析比對，57株光滑念珠菌共檢測出3個非同義突變位點C622T/A2669T、G715T，分別對應氨基酸置換位點為P208S/N890I、V239L。19株氟康唑耐藥菌株有17株發生MSH2基因突變，其中涉及C622T/ A2669T突變2株，涉及G715T突變15株，未發現3個非同義突變位點同時出現在同一菌株；15株氟康唑S-DD菌株有13株發生MSH2基因突變，均只涉及G715T一個非同義突變位點；23株敏感菌株有10株發生MSH2基因突變，也均只涉及G715T一個非同義突變位點。見表3。

設α=0.05為檢驗水準，氟康唑耐藥組出現MSH2基因突變頻率(89.5%)與S-DD組(86.7%)、敏感組(43.5%)比較，差異具有統計學意義(χ2=13.162，P=0.002)。兩兩比較，以α′=0.016 7 為檢驗水準，結果提示：耐藥組MSH2基因突變頻率顯著高于敏感組(χ2=9.587，P=0.003)；耐藥組與S-DD組比較，差異無統計學意義(χ2=0.064，P=1.000)；中介組與敏感組比較，差異有統計學意義(χ2=7.088，P=0.016)。

表3 3組實驗菌株出現MSH2基因突變情況

3 討論

近年來，光滑念珠菌已成為全球第二大引起侵襲性真菌感染的病原體[7]，目前可用于一線治療的抗真菌劑有限，且考慮藥物對人體副作用(如兩性霉素B的腎毒性)及藥品價格方面，臨床較常使用唑類藥物。研究[8-9]表明，光滑念珠菌對氟康唑的耐藥率逐年升高，Xiao et al[8]通過對中國醫院侵襲性真菌檢測網研究顯示2009～2014年間光滑念珠菌對氟康唑的耐藥率從12.9%上升至24.0%，國外也有類似報道[9]。本研究顯示，2017年7月～2018年7月從我院收集的光滑念珠菌對氟康唑耐藥率達22.9%，對伊曲康唑等其它4種抗真菌藥有不同程度耐藥，同時存在交叉耐藥和多藥耐藥現象，這與文獻[8]報道基本一致。 相關研究表明，光滑念珠菌易對唑類產生耐藥[10]，通常與ATP結合轉運蛋白和易化擴散載體超家族蛋白(如CDR1、SNQ2等)表達上調有關[9]，從而有效的將藥物泵出細胞外，同時藥物外排泵上調通常伴隨轉錄因子PDR1獲得性突變[11]，但目前尚不清楚光滑念珠菌為何能快速獲得對多種藥物的耐藥性。

MMR系缺陷的菌株可增強基因水平轉移的頻率[4]，相關研究[12]顯示，缺乏DNA MMR系統的細胞，可大大提高自發突變的速率。Legrand et al[5]通過構建白色念珠菌MSH2Δ菌株，研究發現MSH2基因突變可致氟康唑耐藥菌落的出現頻率增加。同時，Healey et al[1]通過研究357株光滑念珠菌MSH2基因突變情況及建立MSH2Δ光滑念珠菌胃腸定植小鼠模型，發現DNA修復系統缺陷可能是導致負責調控耐藥性的各種基因變化加速的原因。本實驗通過研究57株光滑念珠菌MSH2突變情況，結果顯示氟康唑耐藥組、S-DD組MSH2基因突變頻率明顯高于敏感組，因此MSH2基因突變可能與氟康唑耐藥有關。本次研究顯示的P208S/N890I、V239L氨基酸置換位點與國外報道[1,6]一致，但未發現E231G、L269F等國外報道的其他氨基酸置換位點，這可能與實驗菌株數相對較少或地理差異有關。此外，本實驗顯示P208S/N890I氨基酸置換位點只出現在耐藥組中，可能其與出現氟康唑耐藥相關性較高，這有待進一步生物學驗證。同時，本研究顯示敏感組也出現相對較高的MSH2基因突變頻率，且有文獻[13]報道MSH2基因突變出現在耐藥性出現之前，這可能初步解釋了光滑念珠菌為何能快速獲得對氟康唑的耐藥性，但仍需進一步深入研究；也可能與患者基礎疾病較多、接觸較多藥物(如抗生素、抗腫瘤藥物等)有關。此外，已有研究[1]通過對連續臨床光滑念珠菌分離株的分析，結果表明MSH2基因突變發生在耐藥性出現之前。

雖然有研究表明DNA MMR基因MSH2基因突變與氟康唑耐藥有關，但Dellière et al[6]研究提出光滑念珠菌對氟康唑的耐藥性與抗真菌藥物暴露相關，且相關性優于MSH2基因突變。由于病歷資料不完善，本實驗未考慮患者抗真菌藥物的暴露情況。另外，Healey et al[1]發現從部分醫院獲得的光滑念珠的MSH2基因突變頻率在氟康唑敏感組與耐藥組有相似水平，表明MSH2基因突變存在地理差異。

本研究為闡明光滑念珠菌MSH2基因突變與氟康唑耐藥有一定關系，但MSH2突變是否導致DNA MMR蛋白表達下降，或功能活性降低，或參與調控其它耐藥基因如藥物外排泵等，有待進一步探討。耐藥機制的形成，復雜且多樣性[14]，對其深入研究有助于臨床治療和指導用藥。