IL-22基因單核苷酸多態性與結直腸癌易感性和臨床病理參數的相關性

葉石才，鄭學寶,2，朱 朱，周 宇，鐘 宇，黃 哲，王永存，葉 華，鄒 穎，馮錦山，遲宏罡，朱宇珍

結直腸癌是世界范圍內高發的惡性腫瘤之一，發病率和死亡率在男性和女性患者中均位列第三位。隨著我國經濟的發展、人民生活方式和膳食結構的改變，結直腸癌的發病率呈逐年上升的趨勢，已躍居為我國排第四位的惡性腫瘤性疾病，中晚期占大多數[1]。不同臨床分期的結直腸癌的治療方法不同，準確判斷腫瘤的病理及臨床分期非常重要。結直腸癌是多基因改變、多因素影響、多階段發展的高度惡性腫瘤，其中宿主的遺傳易感性在結直腸癌發病中的作用越來越受到重視[2]。目前已發現多種基因直接參與和調節機體的免疫應答，并決定這人群或個體易感性的差異[3-7]。

IL-22是IL-10家族成員之一，介導上皮免疫和黏膜組織修復，主要由激活的αβ T細胞、γδ T細胞、NK T細胞和固有淋巴細胞(innate lymphoid cells，ILCs)分泌。目前諸多研究[8]表明IL-22在結直腸癌的天然和獲得性保護性免疫中起重要作用，且參與調節腫瘤細胞增殖和細胞周期的信號通路，但宿主基因對其功能的調控及其與結直腸癌的易感性的關系尚不清楚。有關IL-22基因多態性可能與結直腸癌易感性的研究鮮有報道。該研究主要是對IL-22基因單核苷酸多態性進行研究，探討SNP位點(rs2227474和rs2227483)與結直腸癌發病的關系，以及其是否與結直腸癌患者的臨床特點、病理特征有相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑和儀器 全血DNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司；熱啟動Taq酶購自日本TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司；紫外分光光度計NanoDrop購自美國Thermo Scientific公司；實時熒光定量PCR-7500儀購自美國ABI公司。

1.1.2病例資料 選取廣東醫科大學附屬醫院確診結直腸癌患者306例。按照《結直腸癌診療規范(2015年版)》診斷標準，通過磁共振成像(MRI)或計算機斷層掃描(CT)檢查腫瘤大小和區域淋巴結轉移情況。臨床階段根據國際癌癥防治聯盟(UICC)標準進行分級。結直腸癌患者均經組織病理學檢查或在抽血前沒有接受治療。健康對照組為醫院體檢者358例。所有研究對象簽署由廣東醫科大學附屬醫院倫理委員會批準的知情同意書，符合醫學倫理學規定。

1.2 方法

1.2.1DNA的提取及純化 用肝素鋰抗凝管收集靜脈血，采用Qiagen 全血DNA抽提試劑盒提取基因組DNA，嚴格按照說明書操作。質量控制：取DNA樣本2 μl，用紫外分光光度計NanoDrop測定DNA純度和濃度，若OD260/OD280>1.8，OD260/OD230>2.0，則DNA純度合格。

1.2.2引物設計與合成 TaqMan探針和引物設計采用7500實時熒光定量PCR儀隨機軟件Primer Express 3.0設計。rs2227473和rs2227483位點設計的兩條探針分別采用美國AB公司的VIC和FAM 進行熒光標記。

1.2.3SNP等位基因分型 取純度合格的DNA樣本，在384孔板擴增待測樣本，反應體系為10 μl，其中通用PCR混合液(2×TaqMan genotyping Master Mix)5 μl，引物與探針混合液(40×TaqMan SNP Genotyping Assay Mix)0.25 μl，DNA(50 ng/μl)1 μl。PCR擴增反應條件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，共40個循環。在PCR擴增過程中，若樣本為等位基因1的純合子時，僅可檢測到VIC熒光；若樣本為等位基因2的純合子時，僅可檢測到FAM熒光；若樣本為雜合子時，可同時檢測到FAM和VIC兩種熒光。

1.3 統計學處理采用GraphPad Prism 6軟件進行統計分析，以P<0.05表示差異有統計學意義。采用χ2檢驗確定結直腸癌組與健康對照組的等位基因頻率的差異，進一步通過計算比值比(odds ratio，OR)和95%可信區間(95% confidence intervals，95%CI)來評估結直腸癌發生與IL-22等位基因的相關性。分析結直腸癌患者不同基因型與臨床病理表型的相關性，如年齡、性別、血清癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、原發腫瘤延長、淋巴結狀態、轉移和腫瘤分期等。

2 結果

2.1 研究人群特征結直腸癌組和健康對照組之間年齡差異無統計學意義(χ2=0.483，P>0.05)。 其中結直腸癌組和健康對照組性別差異無統計學意義(χ2=0.576，P>0.05)，提示結直腸癌組和健康對照組間具有可比性。見表1。

表1 研究人群特征

2.2 rs2227473、rs2227483位點的多態性與結直腸癌的易感性的關聯性分析通過對兩組人群rs2227473、rs2227483位點的基因分型進行分析，結果顯示rs2227473位點的單核苷酸多態性與結直腸癌的易感性相關，兩者之間的差異具有統計學意義(P=0.000 3)，rs2227483位點的單核苷酸多態性與結直腸癌的易感性無相關性(P=0.99)。見表2。

2.3 rs2227473、rs2227483位點的多態性與結直腸癌CEA的關聯性分析血清CEA水平能預測結直腸癌的預后及復發，是應用于臨床的結直腸癌腫瘤標志物中重要的一種。通過分析結直腸癌患者rs2227473、rs2227483位點多態性與CEA的相關性，結果顯示rs2227473、rs2227483位點的單核苷酸多態性與結直腸癌的易感性無相關性(P=0.93，P=0.88)，見表3。

表2 rs2227473、rs2227483位點的多態性與結直腸癌的易感性的關聯性分析

表3 rs2227473、rs2227483位點的多態性與結直腸癌CEA的關聯性分析

表4 rs2227473、rs2227483位點的多態性與結直腸癌原發腫瘤(T)的關聯性分析

表5 rs2227473、rs2227483位點的多態性與結直腸癌區域淋巴結(N)的關聯性分析

表6 rs2227473、rs2227483位點的多態性與結直腸癌區域遠處轉移的關聯性分析

表7 rs2227473、rs2227483位點的多態性與結直腸癌臨床分期的關聯性分析

2.4 rs2227473、rs2227483位點的多態性與結直腸癌原發腫瘤(T)的關聯性分析統計分析rs2227473、rs2227483位點多態性與結直腸癌原發腫瘤的相關性，結果顯示rs2227473、rs2227483位點的單核苷酸多態性與結直腸癌原發腫瘤的浸潤程度無相關性(P=0.71，P=0.84)，見表4。

2.5 rs2227473、rs2227483位點的多態性與結直腸癌區域淋巴結(N)的關聯性分析結果顯示rs2227473、rs2227483位點的單核苷酸多態性與結直腸癌區域淋巴結轉移無相關性(P=0.76，P=0.71)，見表5。

2.6 rs2227473、rs2227483位點的多態性與結直腸癌區域遠處轉移的關聯性分析通過對rs2227473、rs2227483位點的多態性與結直腸癌區域遠處轉移的關聯性分析，結果顯示，二者均無相關性(P=0.39，P=0.92)，見表6。

2.7 rs2227473、rs2227483位點的多態性與結直腸癌臨床分期的關聯性分析根據臨床分期標準，結直腸癌患者分為Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期。結果顯示，rs2227473位點G在Ⅰ+Ⅱ期患者中的基因頻率為80.3%，在Ⅲ+Ⅳ期患者中的基因頻率為91.6%，差異具有統計學意義(P<0.000 1)。rs2227483位點在Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期的基因頻率差異無統計學意義，見表7。

3 討論

結直腸癌易感基因的篩選和確定，不僅是結直腸癌發生高危人群預測診斷和制定相應干預決策的依據，同時也是結直腸癌靶向基因和藥物治療的基礎。隨著結直腸癌易感基因研究的不斷深入，已發現有大量的易感基因SNP與結直腸癌易感性存在相關性。COX-2基因多態性-765G/C與結腸直腸癌特別是直腸乙狀結腸癌的易感性增加有關[4]；血管緊張素轉換酶(ACE)插入/缺失(I/D)多態性可能增加結直腸癌患者淋巴結轉移的發病風險[5]；IL-10基因-592A/C降低了結直腸癌的風險[6]；細胞間黏附分子1(ICAM-1)基因K469E多態性與結直腸癌易感性和多藥耐藥性高度相關[7]； MYCrs11777210被證實是結腸直腸癌高風險基因多態性位點，可作為潛在預測性生物標志物之一[8-10]。

IL-22早期研究主要集中在炎癥性疾病與自身免疫性疾病，最近研究[10]表明，IL-22在腫瘤的免疫調節中也發揮著重要作用。Zhuang et al[11]通過免疫熒光雙染的方法證實了胃癌組織中存在Th22細胞的表達；通過對76例胃癌患者研究進行分析，顯示腫瘤組織中CD4+IL-22+T細胞比例在腫瘤組織中明顯高于腫瘤引流淋巴結、非腫瘤以及癌旁組織。同時該研究還顯示Th22細胞低表達的患者在21個月的生存率方面明顯優于高表達的患者，表明Th22細胞的髙表達意味著較差的預后。Liu et al[10]通過對32例胃癌患者和19例健康志愿者外周血的單個核細胞進行流式細胞技術檢測，發現表達IL-22的輔助性T細胞和Th22細胞在胃癌患者中高度表達，同時Th22細胞旳比例與IL-22濃度呈正相關性，IL-22在進展期胃癌患者的表達量明顯高于早期胃癌患者，表明IL-22與胃癌的病情進展密切相關。研究表明結直腸癌患者的腫瘤組織及癌旁組織中均存在IL-22蛋白的表達，但腫瘤組織中表達更為明顯，且TNM Ⅰ～Ⅳ期的Th22細胞比例明顯髙于TNM Ⅰ～Ⅱ期，提示IL-22細胞結直腸癌微環境中聚集，并且隨著腫瘤的進展含量增高，表明IL-22或許可以作為結直腸癌患者評價預后的一項重要指標[11-12]。

人IL-22基因位于12q15，大約距離IL-26編碼基因上游52 kb，距離IFNG編碼基因上游99 kb。整個編碼區位于30 785 331 nt～30 790 587 nt 之間的約5.3 kb，共包含5個外顯子。開放讀碼框長度537 bp，編碼蛋白長度179個氨基酸[10]。IL-22及其受體(IL-22RA1/IL-22RA2)基因單核苷酸多態性與多種疾病的易感性有關，包括炎癥反應性疾病、腫瘤和慢性感染性疾病。其中，IL-22基因SNP(rs1179251)被報道與大腸癌易感性有關[12]；IL-22基因SNP(rs1012356、rs1179251和rs2256111)可能與 HCV感染后的病毒清除和干擾素治療應答反應有關[13]，此外，IL-22RA1 基因SNP(rs4292900、rs4648936和rs16829225)與重癥慢性鼻鼻竇炎的發生密切相關[14]；IL-22RA2基因SNP(rs276474)與多發性硬化的發生有關，其具體機制與 IL-22RA2 基因多態性對巨噬細胞功能調節有關[15]。本研究檢測了結直腸癌患者和健康對照者IL-22兩個SNP位點(rs2227483和rs2227473)的多態性，結果提示IL-22基因rs2227473位點與結直腸癌的易感性有相關性；除此以外，IL-22基因rs2227473位點與臨床分期有顯著相關性。這些數據表明，IL-22基因rs2227473位點不僅參與癌癥的起始，而且可能參與結腸直腸癌的進展。但是這個位點與CEA、原發腫瘤擴展情況、淋巴結狀態和轉移情況的參數之間無顯著相關性。因此，推斷IL-22基因型可能是結直腸癌患者生存的預測指標。

綜上所述，IL-22基因rs2227473多態性與結直腸癌的易感性和臨床分期相關，其中攜帶等位基因G增加結直腸癌的發生風險。但本研究的研究對象具有樣本量小、地域局限和人種差異小等缺陷，因此，為進一步揭示IL-22基因多態性與結直腸癌的關系，在不同國家、地區和種族的人群中進行大樣本的研究是很有必要。