卵白蛋白誘導(dǎo)家兔過敏性紫癜動物模型的建立和評價

侯兆玉，張曉翠，張紅利，鄧 芳

過敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura，HSP)是一種好發(fā)于兒童、以IgA免疫復(fù)合物沉積為主的自身免疫性小血管炎[1]。該病常易累及皮膚、胃腸、腎臟、關(guān)節(jié)等全身各部位，臨床表現(xiàn)為皮膚紫斑、腹痛、消化道出血、蛋白尿、血尿、關(guān)節(jié)腫痛等。HSP病因未明，目前多認(rèn)為與其發(fā)病關(guān)系密切的因素有：感染、藥物、食物及遺傳因素等[2]。臨床HSP的診斷主要依據(jù)EULAR/PReS統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，可觸性皮疹(必要條件)伴以下任何一條：① 彌漫性腹痛；② 任何部位活檢示IgA沉積；③ 關(guān)節(jié)炎/關(guān)節(jié)痛；④ 腎臟受損表現(xiàn)(血尿、蛋白尿)。目前對HSP的發(fā)病機制尚未完全明確，因此限制了對其發(fā)病機制、診斷和治療的研究。而國內(nèi)外對HSP動物模型報道甚少，并沒有成熟的實驗動物模型。該研究參考李彥紅 等[3]通過卵白蛋白(ovalbumin，OVA)誘導(dǎo)家兔引起Ⅲ型超敏反應(yīng)的原理建立HSP的模型，通過監(jiān)測其相關(guān)實驗室指標(biāo)及病理結(jié)果，驗證建模成功與否，并對HSP發(fā)病機制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑干姜(批號：20171107)、蓽茇(批號：20150610)、胡椒(批號：170701)購自安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院；OVA(A5503)、弗氏完全佐劑(F5881)購自美國Sigma公司；IgA抗體(ab97189)購自英國abcam公司。

1.2 主要儀器XE-2100型全自動血液分析儀(日本SYSMEX公司)；SA-9000全自動血流變分析儀(北京賽科希德科技發(fā)展有限公司)；H-800型全自動尿液分析儀(長春DIRUI公司)；c702全自動生化分析儀(瑞士cobas公司)；RM2245石蠟切片機(德國Leica公司)；KD-2950冰凍切片機(鄭州南北儀器設(shè)備有限公司)；IX71倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.3 實驗動物及模型制備

1.3.1實驗動物 家兔20只，體質(zhì)量1.2～1.4 kg,安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。動物在實驗室正常飼養(yǎng)1周后，隨機分出10只為對照組，其余10只為模型組。

1.3.2模型制備 模型組家兔給予配方中藥煎劑喂飲，由干姜、蓽茇、胡椒的水煎劑構(gòu)成，配比為1 ∶1 ∶1，終濃度為15 g/100 ml，1次/d，每次1 ml，連續(xù)3周；對照組給與等量生理鹽水喂飲。模型組末次喂飲當(dāng)日，腹腔注射乳化溶液(10 mg的OVA溶解于0.5 ml的生理鹽水中，再與0.5 ml弗氏完全佐劑完全乳化)1 ml，1次/周，連續(xù)3周。對照組給予等量生理鹽水腹腔注射。最后一次腹腔注射1周后，模型組兔通過耳緣靜脈注射濃度為10 mg/ml的OVA生理鹽水溶液0.5 ml，同時后背剃毛，皮內(nèi)注射0.3% OVA生理鹽水溶液1 ml，共注射5點，每點0.2 ml。對照組分別以相同的方法和劑量皮內(nèi)注射生理鹽水。注射后用代謝籠收集24 h尿液，并記錄尿量。觀察對比模型組和對照組動物的一般情況、皮膚紅腫狀況，照相存檔。24 h后耳緣動脈取血，檢測實驗室指標(biāo)。3周后處死取皮膚、腎臟組織，觀察病理結(jié)果。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1一般參數(shù)觀察、檢測 實驗前后，觀察兩組動物的活動及精神狀況等。24 h后分別用含EDTA的抗凝管和含惰性分離膠的促凝管自動物耳緣動脈取血，用含EDTA的抗凝管收集2 ml動脈血，全自動血細(xì)胞分析儀檢測血常規(guī)、全自動血流變分析儀檢測血液流變性。再用含惰性分離膠促凝管收集2 ml動脈血，使用離心機，4 000 r/min離心15 min, 取血清測免疫球蛋白A(immunoglobulins A,IgA)、免疫球蛋白G(immunoglobulins G,IgG)、免疫球蛋白E(immunoglobulins E,IgE)、補體C3、補體C4等指標(biāo)。兔代謝籠收集24 h尿液后，用全自動尿液分析儀檢測尿常規(guī)、24 h尿蛋白等指標(biāo)。末次注射結(jié)束后，觀察并拍照模型組背部皮膚表現(xiàn)：是否有紅腫、瘀斑及瘀斑大小、瘀斑分布狀況、隨時間改變的情況。

1.4.2病理組織學(xué)觀察 模型組及對照組兔放血后,取出雙側(cè)腎和背部皮膚, 將一側(cè)腎和部分皮膚置于組織包埋液(OCT)中包埋,液氮罐中放置5 min,然后取出在冰凍切片機中切片，用直接法測抗原抗體復(fù)合物，熒光顯微鏡下觀察腎小球IgA沉積強度。免疫熒光強度判定選擇國際通用的5級半定量法描述IgA沉積的強度，每張切片最少觀察20個腎小球(×400):低倍鏡下不能顯示、高倍鏡下似乎可見為(-)，低倍鏡下似乎可見、高倍鏡下可見為(+)，低倍鏡下可見，高倍鏡下清晰可見為()，低倍鏡下可見，高倍鏡下耀眼為()，高倍鏡下刺眼為()[4]。另一側(cè)腎及其剩余皮膚，4%多聚甲醛溶液固定,梯度脫水后，石蠟包埋，切片，腎臟進(jìn)行HE、PAS、Masson染色，皮膚行HE染色，由兩名病理醫(yī)師進(jìn)行光鏡下盲片審閱。

2 結(jié)果

2.1 一般情況及皮膚變化實驗過程中，模型組和對照組家兔均未出現(xiàn)死亡。模型組兔在實驗結(jié)束后，即表現(xiàn)為精神差、活動量減少，進(jìn)食進(jìn)水量減少，對照組無此反應(yīng)。皮內(nèi)注射OVA后，模型組中6只家兔在8 h左右，注射部位皮膚出現(xiàn)出血斑點，隨時間進(jìn)展，皮下出血點逐漸增大，24 h左右，呈現(xiàn)片狀紫斑伴周圍紅腫，形狀不規(guī)則，直徑為1 cm左右(圖1B)。對照組則無明顯改變(圖1A)。

表1 兩組血液黏稠度對比

圖1 對照組及模型組家兔皮內(nèi)注射OVA后注射部位皮膚變化情況

2.2 實驗室指標(biāo)變化

2.2.1血液流變性及血、尿常規(guī)檢測結(jié)果 血液流變性：造模后模型組動物的血液黏稠度在不同剪切率下均較對照組明顯增高(P<0.001)，紅細(xì)胞壓積也明顯增高(P<0.001)。見表1。血常規(guī)：造模后，與對照組比較，模型組血紅蛋白(hemoglobin,HGB)含量、紅細(xì)胞(red blood cell，RBC)數(shù)均低于對照組(P<0.001)，白細(xì)胞(white blood cell，WBC)數(shù)、嗜堿性粒細(xì)胞百分比(basophilic，BASO%)均高于對照組(P<0.001)，血小板(platelet，PLT)計數(shù)無明顯改變。見表2。尿常規(guī)：造模后模型組與對照組相比，尿蛋白和尿紅細(xì)胞均顯著增多(P<0.001)。見表3。

表2 兩組血常規(guī)對比

2.2.2動物模型IgA、IgG、IgE、C3、C4檢測結(jié)果 造模后模型組動物與對照組相比，血清免疫球蛋白IgA升高(P<0.001)，補體C3減少(P<0.001)，IgG、IgE、C4無明顯改變。見表4。

表3 兩組尿常規(guī)對比

表4 兩組血清IgA、IgG、IgE、C3、C4檢測結(jié)果

2.3 病理組織學(xué)結(jié)果

2.3.1皮膚及腎組織HE染色 組織切片HE染色后，光鏡下可見模型組皮膚皮下出血、真皮水腫、血管擴張充血、出血，炎性細(xì)胞浸潤，見圖2；模型組腎組織腎小球系膜增厚、系膜細(xì)胞及基質(zhì)增生、囊腔蛋白滲出及局灶性腎小球腎炎，見圖3。

圖2 對照組及模型組家兔皮膚HE染色圖 ×100

圖3 對照組及模型組家兔腎臟HE染色圖 ×400

2.3.2皮膚及腎組織免疫熒光染色 組織免疫熒光染色顯示，模型組皮膚真皮小血管壁大量IgA沉積IgA()，對照組皮膚IgA(-)，見圖4；模型組腎臟系膜區(qū)IgA顆粒狀沉積IgA()，對照組IgA(-)，見圖5。

圖4 對照組及模型組家兔皮膚IgA免疫熒光圖 ×400

圖5 對照組及模型組家兔腎臟IgA免疫熒光圖 ×400

3 討論

HSP是一種以IgA免疫復(fù)合物沉積為主的自身免疫性血管炎疾病，當(dāng)前對HSP的發(fā)病機制尚未完全研究清楚，最理想的治療方案也未完全明確。因此建立HSP模型，研究其確切的機制對于治療HSP有重要意義。

HSP病因不明，目前多認(rèn)為急性鏈球菌感染與其發(fā)病關(guān)系密切，但有研究[5]顯示急性期鏈球菌感染可引起家兔心肌缺血及血壓變化, 外周血小板和白細(xì)胞明顯減少，使模型兔生存率降低而影響造模穩(wěn)定性。中醫(yī)學(xué)說認(rèn)為HSP與古籍所記載的“血癥”、“斑疹”等相似[6]。近年來，也有許多學(xué)者嘗試采用中醫(yī)療法治療本病,并在臨床實踐中取得了很好療效[7-8]。HSP發(fā)生發(fā)展的病生過程可以看成免疫復(fù)合物引起的Ⅲ型超敏反應(yīng)，本研究中首先對模型組家兔予以配方中藥煎劑喂飲，構(gòu)建中醫(yī)學(xué)說中“陰虛質(zhì)燥”，再予以定期腹腔注射含OVA的乳化溶液使其致敏，最后皮下注射一定濃度的抗原激發(fā)實驗，正是利用Ⅲ型超敏反應(yīng)的原理。本實驗中以免疫復(fù)合物的沉積、炎癥介質(zhì)、腎臟損傷指標(biāo)及病理改變等作為觀察指標(biāo)進(jìn)行造模技術(shù)的研究，以求能反映HSP的本質(zhì)特征。

HSP患兒的體質(zhì)大多為血瘀質(zhì)，血液運行不暢，容易離經(jīng)發(fā)展為紫癜。模型組家兔血液黏稠度增高，與中醫(yī)學(xué)說的血瘀質(zhì)相吻合。從西醫(yī)臨床角度，HSP患者免疫系統(tǒng)、激肽及纖溶系統(tǒng)功能紊亂[9]，使得血液黏度增高、血液流速降低，這又進(jìn)一步加重了組織供氧的降低，代謝紊亂。血液黏稠度的增高以及炎癥反應(yīng)也必將影響血常規(guī)的結(jié)果，使得白細(xì)胞增高。過敏性疾病也常導(dǎo)致嗜堿性粒細(xì)胞的升高，這些理論也與本實驗結(jié)果相同。HSP本身為一種侵犯皮膚及細(xì)小血管急性自限性出血癥，過程中無血小板的消耗。

HSP性腎炎(HSPN)是HSP最嚴(yán)重的并發(fā)癥，其發(fā)病率一般以尿常規(guī)計，國內(nèi)外報道尿常規(guī)改變在HSP中發(fā)生率約30%～60%[10]。甚至有學(xué)者認(rèn)為HSP同時并發(fā)腎損害，只是輕重程度因人而異，大多數(shù)預(yù)后良好，僅少部分可發(fā)展為慢性腎功能不全，甚至是終末期腎病[11]。本實驗中，尿常規(guī)顯示模型組家兔存在腎功能受損的現(xiàn)象。病理檢測亦顯示，腎小球系膜增厚，系膜細(xì)胞及基質(zhì)增生、囊腔蛋白滲出。免疫熒光中，腎小球系膜區(qū)IgA免疫復(fù)合物呈顆粒狀沉積。

模型組家兔血清中IgA含量升高, 與臨床患者相關(guān)血清學(xué)檢測具有一致性，HSP臨床各型患者，急性期皮膚小血管壁及腎小球系膜區(qū)可有大量IgA沉積，這也提示IgA與HSP發(fā)病過程關(guān)系密切[12]。IgE是血清中含量最少的免疫球蛋白，主要參與I型超敏反應(yīng)，具有與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞結(jié)合的免疫功能。有研究[13]表明變態(tài)反應(yīng)也是致HSP的重要因素，其中多數(shù)患者被多種過敏原致敏，本研究并未采用過敏源致敏的方式構(gòu)建HSP，這可能與IgE無明顯變化有關(guān)。模型組家兔血清中C3、C4含量的降低，表明補體系統(tǒng)存在過度激活現(xiàn)象。

熱性中藥煎劑喂飲后及時檢測其血液黏稠度，使其與中西醫(yī)所共識的過敏性體質(zhì)的構(gòu)建相一致；血清中免疫球蛋白和補體的檢測，與李彥紅 等[3]的研究相比，可進(jìn)一步全方位的模擬HSP患者的發(fā)病特點和病情轉(zhuǎn)歸。成功建立了HSP的動物模型，其一般表現(xiàn)、血液學(xué)改變、腎功能及腎臟病理改變與人HSP基本一致，說明此方法建立HSP模型具有可行性，但實驗中并非均出現(xiàn)皮膚紫癜，其原因可能與免疫反應(yīng)的個體差異性有關(guān)，且由于實驗條件和成本有限，實驗尚有檢測指標(biāo)的不足，比如并未做腎臟病理電鏡圖等更為準(zhǔn)確的檢測紫癜腎臟損傷情況，有待進(jìn)一步思考和實驗研究。但總體來說，該造模方法成本較低、操作簡便，可得到較為穩(wěn)定的HSP動物模型，為研究HSP的病因和發(fā)病機制，以及臨床治療HSP提供科學(xué)依據(jù)和創(chuàng)新方法。