霍亂毒素B亞單位對小鼠免疫細胞及細胞因子的影響

李向陽，楊 瑩，張勵才，顏 超，孔凡運，鄭葵陽，湯仁仙

霍亂腸毒素(cholera toxin,CT)是霍亂弧菌的主要毒力因子，CT具有A亞單位(CTA)和B亞單位(CTB)，兩者能形成緊湊而穩定的六聚體蛋白，A亞單位是霍亂毒素的活性部分，B亞單位能與有核細胞細胞膜上的神經節苷酯(monosialoganglioside，GMl)結合，基于這一原理，使得CTB可以選擇性地被那些富含神經節苷脂GM1的神經細胞所攝取，從而特異性地標記神經細胞。CTB除去了CT的毒性，具有很強的免疫原性，能夠有效刺激機體分泌抗毒素抗體，是目前用的最多的黏膜免疫佐劑之一[1-2]。但是對于機體免疫系統的影響，尤其是作為神經元示蹤劑，在對小鼠進行側腦室注射之后對免疫系統的影響沒有相關文獻報道。該研究通過運用CTB對C57小鼠進行側腦室注射，觀察小鼠免疫系統的表現，包括免疫細胞、炎癥因子、趨化因子的變化，為后續的實驗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物7～8周齡SPF級雌性C57小鼠20只，20 g/只，由徐州醫科大學實驗動物中心提供，飼養于徐州醫科大學實驗動物中心，環境溫度25 ℃，濕度55%。

1.2 主要試劑霍亂毒素B亞單位(CTB)購自上海Absin公司；Rabbit anti-CTB antibody購自美國Sigma公司；FITC-anti-Rabbit antibody、FITC-anti-MouseCD4、PE-cy7-anti-MouseCD3、APC-Cy7-anti-MouseCD11b、APC-anti-MouseCD19、Percp-Cy5.5-anti-Mouse F4/80熒光抗體均購自美國ebioscience公司；LEGENDplexTMkits購自美國Biolegend公司。

1.3 實驗分組及用藥小鼠分為兩組：磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)組和CTB組。CTB組側腦室注射CTB(250 ng/100 g體質量，PBS溶解)，注射體積為2 μl，對照組注射等體積PBS。

1.4 側腦室注射小鼠經麻醉后，固定于腦立體定位儀，消毒，剪開頭頂皮膚，暴露白色骨縫及前囟點；側腦室注射定位坐標：前囟后0.5 mm，旁開1.0 mm，深2.0 mm；進針深度以針尖刺入硬腦膜為起始，注射量為2 μl/只，注射時間為30 s，停針1 min; 拔出微量進樣器針頭，縫合頭部皮膚。

1.5 免疫熒光檢測觸液核神經元取第7天小鼠腦組織，冰凍切片，切片厚度20 μm，經PBS洗滌，封閉后Rabbit anti-CTB antibody孵育24 h；洗滌后，加FITC-anti-Rabbit antibody孵育2 h后，洗滌，熒光顯微鏡觀察。

1.6 流式細胞術檢測免疫細胞變化取第7天小鼠抗凝血50 μl，分別加入FITC-anti-MouseCD4、PE-cy7-anti-MouseCD3、APC-Cy7-anti-MouseCD11b、APC-anti-MouseCD19 、Percp-Cy5.5-anti-MouseF4/80熒光抗體，4 ℃孵育30 min；經裂紅、洗滌后，流式細胞儀檢測。

1.7 LEGENDplexTMkits檢測炎癥因子變化取第7天小鼠血清25 μl，加入檢測微球及檢測抗體，室溫孵育2 h后，上機檢測，LEGENDplex軟件數據分析。

1.8 LEGENDplexTMkits檢測趨化因子變化取第7天小鼠血清25 μl，加入檢測微球及檢測抗體，室溫孵育2 h后，上機檢測，LEGENDplex軟件數據分析。

2 結果

2.1 免疫熒光標記觸液核神經元免疫熒光結果顯示:CTB組小鼠觸液核神經元染色呈陽性(綠色熒光)，PBS對照組觸液核神經元染色呈陰性(無綠色熒光)。見圖1。

圖1 CTB標記觸液核神經元 免疫熒光×200

2.2 流式細胞術檢測免疫細胞亞群變化流式細胞術結果顯示:CTB組小鼠免疫細胞包括CD4+T細胞、B細胞及單核巨噬細胞均高于PBS對照組(t=8.17、6.85、8.64，P<0.05)，差異有統計學意義。見圖2。

圖2 流式細胞術檢測免疫細胞亞群變化

A：免疫細胞亞群散點圖；B：免疫細胞亞群統計圖；與PBS組比較：*P<0.05

2.3 流式細胞術檢測炎癥因子變化流式細胞術結果顯示：CTB組小鼠炎癥因子包括炎癥因子γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin 6,IL-6)、白細胞介素-9(interleukin 9,IL-9)均高于PBS對照組，差異有統計學意義(t=6.17、4.37、4.52、7.38，P<0.05)。見圖3。

圖3 流式細胞術檢測炎癥因子變化

2.4 流式細胞術檢測趨化因子變化流式細胞術結果顯示:CTB組小鼠趨化因子包括巨噬細胞炎性蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1α,MIP-1α)、巨噬細胞炎性蛋白-1β(macrophage inflammatory protein-1β,MIP-1β)、B淋巴細胞趨化因子(B lymphocyte chemoattractant,BLC)、γ干擾素誘導的單核因子(monokine induced by IFN-γ, MIG)、調節活化正常T細胞表達與分泌的趨化因子(regulated upon activation normal T-cell expressed and secreted, RANTES)、單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1,MCP1)均高于PBS對照組，差異有統計學意義(t=3.77、7.06、2.87、3.38、12.25、4.37，P<0.05)。見圖4。

3 討論

CTB來源于霍亂弧菌，作為霍亂毒素中的非毒性亞單位，能夠與細胞表面的GMl結合，具有跨膜傳遞的作用；它可以選擇性地被神經細胞所攝取，從而特異性地標記神經細胞。此外CTB也具有免疫佐劑活性，能夠刺激機體免疫系統產生免疫應答，能夠增強樹突狀細胞的活化與成熟[3-4]。

圖4 流式細胞術檢測趨化因子變化

本研究通過對C57雌性小鼠側腦室注射CTB試劑來觀察其對免疫系統的影響。實驗結果顯示，CTB能夠明顯改變小鼠免疫細胞狀態，CD4+T細胞、B細胞及單核巨噬細胞明顯升高，同時相關炎性細胞因子、趨化因子也明顯升高。

CTB有很強的免疫原性，能夠調節Th1型和Th2型細胞免疫應答；同時能夠輔助抗原誘導機體分泌特異性抗體，通過調節B細胞免疫應答，產生IgG抗體，此外還可以誘導較強黏膜免疫應答，增強機體抗感染能力[5]。此外本研究又檢測了單核細胞的變化，其數量較正常組明顯升高；單核細胞作為機體固有免疫和獲得性免疫的重要組成部分，參與抗原提呈，吞噬及T細胞功能調節；CTB進入機體以后可以明顯改變單核細胞的免疫應答狀態。CTB通過調節巨噬細胞增加促炎因子的分泌及共刺激分子受體CD80、CD86的表達，導致T細胞活化和分化[6]。

TNF-α屬于TNF超家族成員，免疫細胞、非免疫細胞均可產生，在炎癥反應、細胞凋亡、細胞分化中起重要作用。其主要功能是刺激中性粒細胞吞噬，抗感染，改變細胞的特性，調節其他組織的代謝活性，在炎癥反應中作為前炎癥反應因子起促炎作用[7]。IFN-γ主要由活化的巨噬細胞、T細胞、NK細胞合成分泌，是淋巴細胞增殖、分化的調節性物質，同時發揮抗病毒效應。IFN-γ可以誘導單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、星狀細胞等主要組織相容性復合體類抗原的表達，參與抗原提呈和特異性免疫應答的識別過程[8]。IL-6是一種多功能細胞因子，在急性期免疫反應、宿主防御、造血等方面起重要作用，在炎癥反應中主要發揮促炎作用[9]。IL-9主要由Th9細胞分泌，此外肥大細胞、自然殺傷T細胞細胞等也可以分泌；IL-9與其受體結合后，發揮其生物學作用，如增加肥大細胞在炎癥部位聚集，促進固有淋巴細胞的生存，介導B細胞分化，促進免疫球蛋白E分泌等[10-11]。CTB進入小鼠體內后，作用于免疫系統，免疫細胞活化，大量炎癥因子分泌，尤其以IFN-γ升高最為明顯，進一步調節機體免疫應答。

趨化因子是由組織細胞分泌的小分子蛋白，主要功能是招募血液中的淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞等進入感染發生的部位，在炎癥反應中有重要作用。MCP1是單核/巨噬細胞主要趨化因子，MIP-1α(CCL3)、MIP-1β(CCL4)為巨噬細胞炎性蛋白，三者在趨化單核/巨噬細胞、T細胞的同時激發胞內信號通路，發揮促炎、促吞噬等作用[12-13]。BLC、RANTES 、MIG可趨化嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、B淋巴細胞和T淋巴細胞遷移至炎癥及感染部位[14-15]。本實驗顯示，小鼠注射CTB后以單核細胞相關趨化因子升高最為明顯。這與外周血流式檢測結果相一致。

小鼠側腦室注射CTB以后，可以刺激機體免疫系統，導致免疫細胞、細胞因子發生相應改變，尤其以單核細胞及其相關炎癥因子、趨化因子變化最為明顯，實驗結果為后續的實驗奠定了基礎，但是至于CTB對腦神經元定位示蹤以后，對免疫系統影響的具體機制及其細胞因子之間的網絡關系，仍需進一步探討。