龍血竭總黃酮對免疫性肝纖維化大鼠肝臟中TGF-β1表達的影響

李 睿，江揚帆，童 琳，馬 征，王 超，羅勝勇，許冬瑞

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是由于多種慢性疾病導致的肝臟持續受到損傷并引起肝臟內纖維結締組織異常增生的病理過程。其中肝細胞外基質(extracelluar matrix，ECM)的過度沉積是引起HF的主要發生機制[1-2]。而肝臟中肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)表型的激活及過度增殖又是引發ECM過度沉積的重要誘因。目前觀點認為轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β，TGF-β1)是促進HSC合成ECM的主要細胞因子，其主要是通過與細胞膜上的高親和力的受體(TβR)結合激活胞內的信號通路使HSC活化并增殖，同時產生膠原并抑制ECM的降解[3]。

龍血竭為百合科植物劍葉龍血樹[draeaena cochinchinensis (lour)S. C. Chen]的含脂木材的乙醇提取物，其具有抗炎、增加冠狀動脈血流、抑制血小板聚集、促進組織創面愈合再生、降低一氧化氮合酶(NOS)活性等多種藥理學作用[4]，而其中最主要的有效成為龍血竭總黃酮(SanguisDraconisflavones，SDF)。前期實驗也顯示，SDF對四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)誘導的小鼠急性化學性肝損傷模型具有明顯的保護作用，其能夠降低小鼠血清中透明質酸(hyaluronic acid，HA)酶、層粘連蛋白(laminin，LN)和Ⅳ型膠原(collage type Ⅳ，CⅣ)及谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶的水平，同時改善HF大鼠的肝臟病理損傷程度，但其在機體內的分子機制尚不明確，該研究通過建立大鼠的免疫性肝纖維化(immune hepatic fibrosis，IHF)模型來進一步研究SDF在HF中的作用機制及尋找HF潛在的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物80只SPF級健康SD大鼠，體質量80～100 g，由浙江省實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(浙)2014-0001；合格證號：NO1708170009。

1.2 主要試劑SDF購自廣西中醫藥研究院，紅棕色粉末，批號：2017年1月4日，用紫外分光光度法測定其中總黃酮含量在70%以上，臨用前用0.5%的CMC-Na溶液配制成質量濃度分別為36、18、9 mg/ml的SDF混懸液備；豬血清購自奧地利PAA公司(批號：A07222-764)；秋水仙堿片(0.5 mg/片)購自西雙版納版納藥業有限責任公司(批號：170124)，臨用前用蒸餾水配制成質量濃度為0.01 mg/mL的秋水仙堿混懸液備用；大鼠HA ELISA試劑盒、大鼠Ⅲ型前膠原( procollagen type Ⅲ，PCⅢ)ELISA劑盒、大鼠LN ELISA試劑盒和CⅣ ELISA試劑盒均購自廈門康研生物技術有限公司(批號：170123)；環磷腺苷(cAMP)ELISA試劑盒購自上海晶抗生物工程有限公司(批號：170201)；抗TGF-β1抗體(sc-130348)購自美國Santa Cruz公司；抗β-actin抗體(sc-47778)、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG (H+L)購自北京中杉金橋生物技術有限公司；增強化學發光試劑(ECL)購自美國Pierce公司。

1.3 主要儀器800型離心機(上海手術機械廠)；MODEL 550酶標儀(日本BIO-RAD公司)；FSH-2型可調高速勻漿器(金壇金南儀器制造有限公司)；可控硅控溫水浴鍋(通州滬通實驗儀器廠)；Axioscope A1型病理成像顯微鏡(德國Carl Zeiss公司)；JY200C電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司)；DYCZ-40D型轉印電泳槽、DYCZ-24D型雙垂直電泳槽(北京市六一儀器廠)。

1.4 實驗方法

1.4.1模型建立及分組[5]SD大鼠80只，實驗前適應性飼養1周，取其中狀態良好的大鼠60只(雌雄各半)隨機分成6組，每組10只，分別為正常對照組、模型組、陽性組，SDF低、中、高劑量組。除正常對照組外，其余各組大鼠腹腔注射豬血清，每只每次注射0.5 ml，2次/周，連續注射16周。自造模第12周開始，SDF低、中、高劑量組分別灌胃給予90、180、360 mg/kg SDF混懸液，陽性組灌胃給予秋水仙堿溶液0.1 mg/kg，給藥容積均為1 ml/100 g，正常對照組與模型組灌胃給予等量蒸餾水，每日1次，連續4周。實驗期間所有動物置于安徽省醫學科學研究院屏障環境實驗室常規飼養，溫度18～24 ℃，相對濕度40%～70%，自由飲水攝食。

1.4.2動物標本取材 末次給藥后(禁食12 h)1 h，稱空腹大鼠體質量，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，打開腹腔，腹主動脈取血5 ml離心并取血清，4 ℃冷藏待做ELISA時使用。同時于大鼠腹腔上部仔細分離得到肝臟組織。

1.4.3肝臟組織形態變化觀察 取各組大鼠肝臟左葉置于10%福爾馬林溶液中固定，之后逐級乙醇脫水，石蠟包埋，切片，厚4 μm，常規HE染色，光鏡下觀察各組大鼠肝臟組織結構的變化。每只大鼠肝臟的纖維化程度按照表1進行分級判定并記分，同時采用半定量法進行統計評價。

1.4.4ELISA法檢測血清中HA、PCⅢ、LN和CⅣ的含量 將大鼠腹主動脈抽取的5 ml全血置于室溫自然凝固20 min，之后以3 000 r/min、4 ℃離心20 min后取上清液按照試劑盒說明書測定大鼠血清中HA、PCⅢ、LN和CⅣ的水平。

表1 肝臟纖維化程度判定標準

1.4.5ELISA法檢測肝臟組織中cAMP的含量 從大鼠剩余肝臟中剪取出0.5 g左右肝組織，加入1 ml 0.9%NaCl溶液，用高速勻漿機在冰浴上進行勻漿，以3 000 r/min、4 ℃離心20 min后取上清液按照試劑盒說明書測定肝臟組織中cAMP的水平。

1.4.6TGF-β1蛋白表達的定量分析[6]從剩余大鼠肝臟織中剪取出0.5 g組織并提取其中的總蛋白，選擇5%的濃縮膠和10%的分離膠進行SDS-PAGE分析。電泳結束后將凝膠上的蛋白轉印到PVDF上，37 ℃用脫脂牛奶封閉3 h，用3 ml的1 ∶500稀釋的抗體4 ℃孵育過夜。取出后用含0.05%吐溫20的PBS洗3次，每次10 min，再用3 ml的1 ∶2 000稀釋的相應二抗37 ℃搖床孵育1 h，PBS洗3次，用ECL的試劑盒在暗室中曝光、顯影。使用Image-Pro Plus圖像分析管理軟件對圖像進行灰度掃描，以特異性條帶平均光密度與面積的乘積為有效值，反應蛋白表達水平。

2 結果

2.1 SDF對IHF大鼠肝臟組織形態學的影響HE染色結果顯示，正常對照組大鼠肝臟中肝小葉結構清晰，肝細胞索由中央靜脈向四周放射狀排列，無脂肪變性及壞死。其中僅有少量膠原合成聚集于肝門束并無過度膠原纖維增生。與正常對照組比較，模型組大鼠肝臟中肝小葉正常結構被破壞或消失，少量肝細胞壞死，匯管區可見大量網狀纖維及膠原纖維增生，纖維間隔增厚，肝細胞索排列紊亂，部分可見假小葉形成(P<0.01)。與模型組比較，SDF高、中劑量組及陽性組可以明顯減輕模型大鼠的HF程度(P<0.01)，SDF低劑量組改善情況不明顯(P>0.05)，見圖1、表2。

圖1 SDF對IHF大鼠肝臟組織形態學的影響 HE×400

A：正常對照組；B：模型組；C：陽性組；D：SDF低劑量組；E：SDF中劑量組；F：SDF高劑量組

表2 SDF對IHF大鼠HF程度的影響

與正常對照組比較：**P<0.01；與模型組比較：##P<0.01

2.2 SDF對IHF大鼠血清中HA、PCⅢ、LN和CⅣ含量的影響實驗結果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠血清中HA、PCⅢ、LN及CⅣ的含量明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，陽性組以及SDF高、中劑量組大鼠血清中HA、PCⅢ、LN及CⅣ的含量降低，差異有統計學意義(P<0.05)；SDF低劑量組大鼠血清中HA、PCⅢ、LN及CⅣ的含量改變不明顯，差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

2.3 SDF對IHF大鼠肝組織勻漿中cAMP含量的影響實驗結果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠肝組織勻漿中cAMP含量明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，陽性組以及SDF高、中劑量組大鼠肝組織勻漿中cAMP含量明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)；SDF低劑量組大鼠肝組織勻漿中cAMP含量改變不明顯，差異無統計學意義(P>0.05)。各組之間比較差異有統計學意義(F=80.874，P=0.000)，見圖2。

圖2 SDF對IHF大鼠肝組織勻漿中cAMP含量的影響

1：正常對照組；2：模型組；3：陽性組；4：SDF低劑量組；5：SDF中劑量組；6：SDF高劑量組；與正常對照組比較：**P<0.01；與模型組比較：##P<0.01

表3 SDF對IHF大鼠血清中HA、PCⅢ、LN和CⅣ含量的影響

與正常對照組比較:**P<0.01；與模型組比較:#P<0.05，##P<0.01

2.4 SDF對IHF大鼠肝組織中TGF-β1蛋白表達的影響將各組大鼠肝組織勻漿中總蛋白提取出，以β-actin為內參蛋白，用圖像分析軟件進行圖像處理，計算各組大鼠肝組織勻漿中TGF-β1/β-actin的比值，并以正常對照組為基數1，計算各組比值的相對比例。實驗結果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠肝組織勻漿中TGF-β1蛋白表達明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，陽性組以及SDF高、中劑量組大鼠肝組織勻漿中TGF-β1蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)；SDF低劑量組大鼠肝組織勻漿中TGF-β1蛋白表達改變不明顯，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3。

圖3 SDF對IHF大鼠肝組織中TGF-β1蛋白表達的影響

1：正常對照組；2：模型組；3：陽性組；4：SDF高劑量組；5：SDF中劑量組；6：SDF低劑量組；與正常對照組比較：**P<0.01；與模型組比較：##P<0.01

3 討論

HF主要是由于病毒、化學毒物或藥物以及遺傳和代謝等疾病共同引起的肝臟炎癥和損傷，其會引起肝臟中纖維組織的廣泛增生，最終導致肝硬化的發生，而在此過程中，其病理改變是可以被逆轉的，故早期診斷及給予有效治療能夠減緩或防止HF進展為肝硬化以致肝癌[7]。目前研究HF的動物模型主要包括化學藥物或毒物、慢性酒精中毒致HF以及異種血清致IHF等幾種，而IHF模型與其它模型相比較更加接近于人類HF發病的病理過程，其主要為模擬人體內免疫復合物所致的Ⅲ型過敏反應，與臨床上病毒性肝炎引起的HF類似，且纖維化形成較穩定，對動物整體損傷輕微并有利于進行長期的研究[8-9]，故本次實驗采用豬血清誘導的IHF作為動物模型。

臨床上評估慢性肝病患者病情發展情況和治療效果主要以患者血清中肝纖四項(HA、PCⅢ、LN、CⅣ)含量的高低作為常用指標[10]。其在血清中的水平可以衡量肝臟中炎癥的活動度以及HF的程度，隨著HF嚴重程度的增加血清中肝纖四項含量逐漸升高，且趨勢具有正相關性[11]。在本實驗中，模型組大鼠血清中肝纖四項含量顯著升高，與正常對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)，而SDF高、中劑量組能夠降低模型大鼠血清中肝纖四項的含量，差異有統計學意義，提示SDF能夠有效改善IHF大鼠的HF程度。

目前研究顯示，HF發病的分子病理生理學機制主要是為激活的HSC引起的肝臟中ECM的過渡沉積。HSC起初的激活主要是通過鄰近細胞如竇狀隙內皮細胞、庫普弗細胞(Kupffer cell，KC)、肝細胞等的旁分泌作用引起，而其中內皮細胞及KC細胞能夠通過分泌TGF-β1等細胞因子促使HSC激活并轉化為肌成纖維細胞，使之向損傷部位遷移、增殖并產生Ⅰ、Ⅲ型膠原等ECM，使HF程度不斷加重[12-13]。同時以往的體外實驗[14]也顯示HSC-T6細胞株在TGF-β1的刺激下，細胞膜上抑制型G蛋白表達增加，激活型G蛋白表達降低，胞內的cAMP水平下降，而細胞內的cAMP水平的下降與HSC-T6的增殖與膠原合成密切相關，表明TGF-β1能夠通過抑制G蛋白-AC-cAMP通路降低HSC內的cAMP水平，進而促進HSC的激活。在本實驗中，與正常對照組比較，模型組大鼠肝組織勻漿中TGF-β1蛋白表達明顯升高，cAMP水平下降，差異有統計學意義(P<0.01)，而SDF高、中劑量組能夠顯著降低模型大鼠肝臟中TGF-β1蛋白的表達量，同時升高cAMP水平，提示SDF可能通過降低肝臟內TGF-β1蛋白的表達抑制HSC的增殖和ECM的合成及降解達到減輕HF的目的。