人臍血間充質干細胞移植對腦缺血再灌注大鼠SIRT1-P53通路的影響

李 蒙，李傳文，孫俊啟，管葉明，汪青松

腦梗死是一種發病率、致死率、致殘率、復發率高的神經系統常見疾病，目前溶栓治療在臨床應用中較常見，但因其治療時間窗的限制及再灌注后出現的并發癥，仍存在局限性。尋找一種能有效治療急性腦梗死的方法是研究的重點。近年來發現了一類具有多向分化潛能的原始祖細胞,即人臍血間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)，強大的自我更新能力和高度未分化性促使其在特定因子的誘導下可以分化出多種細胞或組織，修復因缺血造成損傷的組織的結構及功能，誘導神經再生[1]。然而人臍血MSC改善受損神經功能的具體機制尚未深入研究。沉默信息調節蛋白1(silent information regulator protein 1，SIRT1)是一種尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸( nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)依賴的蛋白去乙酰化酶，研究[2]顯示上調SIRT1能通過抑制細胞凋亡和炎癥反應，減輕缺血再灌注損傷，促進神經功能恢復。研究[3]表明，SIRT1所具有的功能可能與促凋亡蛋白P53的去乙酰化有關。該實驗通過觀察人臍帶血MSC移植后腦缺血大鼠靜脈血中SIRT1、P53及其下游BAX表達變化，探討人臍帶血MSC改善腦缺血再灌注損傷的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組40只清潔級SD雄性大鼠，7～8周齡,體質量250～280 g,購自安徽醫科大學實驗動物中心。采取自然光照及自由進食、進水1周后進行實驗。將所有大鼠隨機分為4組:假手術組、模型組、干細胞組、干細胞+EX527 組，每組10只。

1.2 試劑及來源EX527、DMSO(美國Sigma公司)；兔抗SIRT1(北京Bioss公司，批號：AF05132592P)；兔抗BAX(北京Bioss公司，批號：AD102736)；兔抗P53(英國Abcam公司，批號：GR194170-1)；β-actin和二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：109145、109525)；逆轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcriotion-polymerase chain reaction,RT-PCR)的TRIzol試劑盒(美國Invitrogen公司,批號：101002);逆轉錄試劑盒(RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit) (美國Thermo公司,批號：00330969)。

1.3 動物模型制備與干預

1.3.1人臍血MSC分離、培養及鑒定 新生兒臍帶血由解放軍第105醫院婦產科提供，新生兒均為孕周≥37周剖宮產出生，無菌條件下采集40份，知情同意書已由產婦及家屬簽署，每個產婦術前均行感染免疫九項檢查及常規檢查，排除傳染性疾病。人臍血MSC的分離培養由解放軍第105醫院細胞生殖中心完成。

1.3.2動物模型制備 除假手術組外其余3組均采用改良線栓法[4]制備大鼠右側大腦中動脈閉塞模型。造模前大鼠禁食12 h,但不禁水，采用腹腔注射10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)的麻醉方式，麻醉后將大鼠四肢固定于操作臺上，將室溫保持在30 ℃左右，沿頸正中切一約2～3 cm長的切口，將皮膚及肌肉逐層分離，用電凝筆灼燒手術中遇到的小血管，分離出右頸總動脈及右頸內、外動脈。將右頸外動脈結扎，在右頸總及頸內動脈根部遠端約4 mm處用動脈瘤夾夾閉，使用電凝筆將右頸外動脈灼燒離斷，提起右頸外動脈的結扎線，使右頸內、外動脈呈直線，在近右頸外動脈結扎處剪一小口，插入直徑約0.148 mm漁線，漁線抵達動脈瘤夾處時，松開動脈夾，繼續插入至不能再進入，固定漁線，松開另一動脈瘤夾，縫合皮膚。栓塞2 h后輕輕將漁線拉出一截形成再灌注損傷。模型成功的標準：提起大鼠尾部，出現轉頸角度超過10°，腦缺血對側即左前肢屈曲內收，肌張力下降，放置地面爬行時呈典型追尾征，若無此典型行為特征則予以剔除。在缺血期內死亡或出現昏迷及抽搐的大鼠也被棄去。模型制備成功后10 min，準備人臍血MSC生理鹽水稀釋液，將稀釋液1 ml(1×106細胞)經尾靜脈注射至干細胞組及MSC+EX527組大鼠，后者同時經尾靜脈給藥EX527(20 μg/kg)。模型組及假手術組在同一時間點注入等量生理鹽水。假手術組只需分離各動脈。

1.4 神經功能缺損評分大鼠模型制備后1、3、7、14 d，分別對3組大鼠進行評分，采用改良的神經功能缺損評分[5]，共18分,其中輕度：1～6分；中度：7～12分；重度：13～18分。

1.5 熒光定量實驗檢測腦組織中SIRT1、P53、BAX mRNA表達取標本于大鼠腦梗死缺血半暗帶區。RNA的提取：按試劑盒說明書提取總RNA；RT反應：在0.2 ml EP管中，加入總RNA(質量為1 μg)、10 μmol/L Oligo(dT)1 μl、DEPC水補足至12 μl，輕輕混勻、點動離心，PCR儀上65 ℃加熱5 min，立即冰浴3 min，在上述EP管中加入各種試劑，置于42 ℃、60 min，70 ℃、5 min，最后取出上述反應液，即為cDNA，-80 ℃ 保存備用；熒光定量PCR反應：取出cDNA作為熒光定量的模板，反應條件為95 ℃ 5 min、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s,40個循環。以β-actin為內參物，2-ΔΔCt計算所得結果，見表1。

1.6 Western blot法檢測腦組織SIRT1、P53、BAX蛋白表達在腦梗死周邊缺血半暗帶區取標本。組織勻漿及蛋白的提取：剪取組織，稱重，每個樣品重量在100 mg左右，加入RIPA細胞裂解液1 ml(內含1 mmol/L PMSF)進行裂解，12 000 r/min、4 ℃離心15 min，收集上清液，即含有組織總蛋白；電泳：配制10% SDS-PAGE凝膠備用，在收集的蛋白樣品中按照1 ∶4加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，經上樣后進行垂直電泳；分離后采用濕法轉膜至PVDF膜上，漂洗5 min后加入Western封閉液4% BSA，在搖床上緩慢搖動,室溫封閉2 h；分別加入一抗4 ℃孵育過夜，洗滌后加入二抗室溫孵育2 h，再次洗滌；最后使用ECL發光試劑盒來檢測蛋白。

表1 RT-PCR引物序列及產物片段

2 結果

2.1 各組在不同時間點的神經功能缺損評分比較結果假手術組在各時間點評分均為0分。其余3組在第1天的評分比較提示差異無統計學意義(F=1.888，P>0.05)；與模型組、MSC+EX527組比較,MSC組在3、7、14 d神經功能缺損評分明顯降低，差異有統計學意義(F=9.208、9.661、19.592，P<0.01)，見表2。

2.2 RT-PCR檢測結果各組不同時間點缺血半暗帶區腦組織SIRT1、P53、BAX mRNA水平，模型組、MSC+EX527組和MSC組1、7、14 d SIRT1 mRNA表達明顯高于假手術組，差異有統計學意義(F=79.660、77.642、56.911，P<0.01)；MSC組1、7、14 d SIRT1 mRNA表達水平均高于MSC+EX527組和模型組，差異有統計學意義(F=22.781、38.799、191.781，P<0.01),3組兩兩比較差異均有顯著性(P<0.01)，1、7、14 d P53、BAX mRNA表達水平均低于MSC+EX527組和模型組，差異有統計學意義(F=23.925、35.644、29.783,29.149、37.403、60.376，P<0.01),3組兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

2.3 Western blot法檢測結果各組不同時間點缺血半暗帶區腦組織SIRT1、P53、BAX蛋白表達，模型組、MSC+EX527組和MSC組1、7、14 d SIRT1蛋白表達明顯高于假手術組，差異有統計學意義(F=148.589、28.859、198.336，P<0.01)；MSC組1、7、14 d SIRT1蛋白表達均高于MSC+EX527組和模型組，差異有統計學意義(F=112.019、17.032、168.286，P<0.01),3組兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.01)，1、7、14 d P53、BAX蛋白表達均低于MSC+EX527組和模型組，差異有統計學意義(F=51.311、61.330、50.654，12.615、110.423、243.573，P<0.01),3組兩兩比較差異均有顯著性(P<0.05)，見圖2、3。

表2 各組不同時間段神經功能缺損評分比較

與模型組比較：**P<0.01;與MSC+EX527組比較：##P<0.01

圖1 各組不同時間點缺血半暗帶區腦組織SIRT1、P53、BAX mRNA水平

A：1 d各組mRNA水平；B：7 d各組mRNA水平；C：14 d各組mRNA水平；與假手術組比較：**P<0.01；與模型組比較：##P<0.01；與MSC+EX527組比較：△△P<0.01

圖2 1、7、14 d各組蛋白質條帶

A：1 d各組蛋白質條帶；B:7 d各組蛋白質條帶；C:14 d各組蛋白質條帶；1：假手術組；2：模型組；3：MSC組；4：MSC+EX527組

圖3 各組不同時間點缺血半暗帶區腦組織SIRT1、P53、BAX蛋白表達

A：1 d各組蛋白表達；B：7 d各組蛋白表達；C：14 d各組蛋白表達；與假手術組比較：**P<0.01;與模型組比較：##P<0.01；與MSC+EX527組比較：△△P<0.01

3 討論

人臍血MSC具有全能干細胞的特點,與骨髓相比，臍血不僅來源充足，而且免疫原性較弱，能更大程度的耐受抗原配型不符，并且具備采集容易、保存方便、傳代穩定等優點[6]，還能分化成多種類型的細胞如少突膠質細胞、星形膠質細胞等[7]，這些特性使人臍血MSC治療腦缺血損傷成為可能。國內外研究[8-9]表明，人臍血MSC可以經血液循環遷移至腦損傷區域，并存活分化產生神經細胞,促進受損的神經細胞功能改善。

SIRT1可以經去乙酰化使蛋白活性改變，進而發揮多項生物學功能，如抗細胞衰老及凋亡、抗氧化應激及影響細胞能量代謝等[10]。SIRT1通過對轉錄因子P53的去乙酰化抑制其蛋白活性，減輕氧化應激誘導形成的細胞凋亡[11]，P53蛋白活性降低后其轉錄活性也隨之降低，進而減少促凋亡蛋白BAX的表達，從而抑制細胞凋亡[12]。

研究[13]表明通過激動SIRT1-P53通路,使P53去乙酰化,乙酰化P53表達量減少，而由P53啟動轉錄的BAX表達量也減少，可以抑制肝臟缺血再灌注損傷中肝細胞的凋亡。也有研究[14]表明,通過上調SIRT1、降低P53的蛋白表達及乙酰化水平，可以對因對比劑造成的急性腎損傷起到保護作用。在本實驗中，與假手術組比較，其余3組各個時間點的SIRT1蛋白表達均提高，提示SIRT1參與腦缺血再灌注損傷的病理生理過程。與模型組和MSC+EX527組比較，在各個時間點MSC組均明顯提高了SIRT1的蛋白表達，下調了P53、BAX的表達，神經功能缺損評分也顯著降低，提示MSC移植改善大鼠神經功能缺損，對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用機制可能與其激活SIRT1-P53通路，下調促凋亡蛋白P53、BAX的表達有關。

綜上，本實驗研究結果表明，SIRT1-P53通路在腦缺血再灌注損傷后抗細胞凋亡以及改善神經功能缺損中占據重要地位，人臍血MSC移植擁有再生潛力的同時又具備復制性和克隆性，調控細胞和宿主之間特定細胞分化而不過度增殖是研究的重點。近來有研究[15]提示SIRT1在MSC的維持和分化中起重要作用，可以調控MSC的自我更新，SIRT1的過度表達或甚至短期藥理學活化有可能使年老的MSC恢復活力。如何將SIRT1對干細胞的調控作用運用到人臍血MSC移植的實際臨床治療中，有待未來進行深入研究。