SAHA聯合厄洛替尼對H1975肺癌裸鼠移植瘤生長的影響及作用機制的研究

袁 卉，郝吉慶

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)約占所有肺癌的85%，而大部分肺癌確診時已屬于中晚期，其5年生存率約為18%[1]。而針對驅動基因的個體化分子靶向治療已成為晚期NSCLC的標準治療，特別是表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI) 已在臨床上被證實具有顯著的療效和良好的安全性。然而因不可避免地會出現耐藥[2-3]，克服耐藥是亟需解決的難題。組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitor，HDACI)是靶向表觀遺傳的一類新型抑制劑，可通過阻滯細胞周期、誘導細胞分化和凋亡、抑制腫瘤血管生成和腫瘤侵襲轉移等抑制腫瘤生長[4-5]。目前HDACI已在多種惡性腫瘤中應用[6-8]。伏立諾他(suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA)已被美國FDA批準用于治療皮膚T細胞淋巴瘤等腫瘤，厄洛替尼是第一代治療NSCLC的EGFR-TKI，SAHA與厄洛替尼聯合應用在NSCLC中的療效鮮有報道。H1975細胞含有T790M突變，對厄洛替尼耐藥，為尋求逆轉耐藥的新途徑，課題組開展此實驗，前期的體外細胞實驗[9]表明SAHA與厄洛替尼聯用具有協同作用，該實驗主要研究SAHA與厄洛替尼聯用在動物體內是否具有協同作用并探討可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和細胞株50只雌性Balb/c裸鼠，購自江蘇維通利華實驗動物有限公司。合格證編號：NO201717625，許可證號：SCXK(蘇)2016-0003，6～8周齡，體質量(20±2)g，于中國科學技術大學實驗動物中心SPF級環境中飼養。人肺腺癌H1975細胞株購自上海中科院細胞庫。所有動物實驗符合動物倫理委員會標準。

1.2 實驗藥品和試劑SAHA購自美國Target Molecule公司，按說明書配制成5 mg/ml的儲備液；厄洛替尼購自美國Target Molecule公司，按說明書配制成3 mg/ml的儲備液；RPIM 1640培養基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自美國HyClone公司；BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；ECL發光試劑盒購自美國Thermo Scientific公司；TUNEL試劑盒(POD法)購自美國Roche公司；GAPDH、Ki-67、AKT、p-AKT(Ser473)、ERK、p-ERK(Thr202/Tyr204)、mTOR、p-mTOR(Ser2448)均購自美國CST公司；PV-6000通用型試劑盒、山羊抗小鼠IgG二抗、山羊抗兔IgG二抗均購自北京中杉金橋公司。

1.3 實驗方法

1.3.1細胞培養 H1975細胞培養于含10% FBS、1%青鏈霉素的RPIM 1640培養液中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養箱中培養。每1～2 d傳代1次，當細胞達到所需數量時，取對數生長期的細胞，用0.25%的胰酶消化后，制成單細胞懸液。用臺盼藍染色法測定細胞活力，調整細胞數至5×107個/ml，待用。

1.3.2動物建模及分組給藥 Balb/c裸鼠適應性飼養3 d，自由飲水，常規飲食。每只裸鼠右腋下注射H1975細胞0.1 ml，即5×106個細胞。每周測量腫瘤大小、體質量2～3次，腫瘤體積計算公式：TV=1/2ab2,其中a為長徑，b為短徑。根據測量的結果計算相對腫瘤體積(relative tumor volume，RTV)，RTV=Vt/V0，其中V0為分組給藥前(即d0)的腫瘤體積，Vt為每次測量時的腫瘤體積?？鼓[瘤活性的評價指標為相對腫瘤增殖率(T/C)，即治療組RTV與對照組RTV比值的百分比(T/C=TRTV/CRTV×100%)，T/C>60%為無效，≤60%并經統計學處理P<0.05為有效。待腫瘤體積達到100～300 mm3時，選取腫瘤大小均一性較好的荷瘤裸鼠，采用隨機分組法分為4組，每組8只：對照組(PBS)、SAHA組(SAHA 50 mg/kg)、厄洛替尼組(erlotinib 30 mg/kg)、聯合組(SAHA 50 mg/kg+erlotinib 30 mg/kg)，連續灌胃給藥21 d。實驗結束后，CO2窒息法處死裸鼠，剝離腫瘤組織并稱重，計算抑瘤率(TGI)(%)=(對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100%，TGI<40%為無效，≥40%并經統計學處理P<0.05為有效。應用金氏公式計算Q值評估兩藥聯用的效果，Q=1-EA+B/(EA+EB),EA+B表示兩藥聯用時的抑瘤率，EA和EB表示單藥時的抑瘤率。Q<0.85表示兩藥有拮抗作用，0.85≤Q≤1.15表示兩藥有相加作用，Q>1.15表示兩藥有協同作用。剝離的腫瘤組織部分固定于10%的中性福爾馬林中，部分凍存于液氮中，待做后續檢測。

1.3.3Western blot 取凍存于液氮中的腫瘤組織，預冷PBS洗2次，液氮中充分研磨后加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液(RIPA ∶蛋白酶抑制劑：磷酸酶抑制劑=100 ∶1 ∶1)，冰上裂解30 min后于4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液，用BCA法測定蛋白濃度，調整蛋白樣品濃度，將蛋白樣品置于沸水浴中加熱15 min。每孔加30 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，濕轉法轉移至PVDF膜上，用5%的脫脂牛奶或5% BSA室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜后用ECL化學發光試劑盒顯影。以GAPDH蛋白為內參照，應用Image J軟件分析目標條帶灰度值。

1.3.4HE染色 取經福爾馬林固定的腫瘤組織，經脫水、包埋、切片，60 ℃溫箱烤片2 h，經脫蠟水化處理后，蘇木精染色8 min，再沖洗、分化、返藍，伊紅染色數秒后，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察腫瘤組織大體形態結構改變。

1.3.5免疫組織化學(immunohistochemistry, IHC)染色 取經福爾馬林固定的腫瘤組織，脫水、常規石蠟包埋、連續切片、烤片，之后脫蠟、水化，微波抗原修復，3%的H2O2消除內源性過氧化物酶活性，一抗4 ℃孵育過夜，用已知陽性切片作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照，二抗37 ℃孵育30 min后DAB染色、蘇木精復染，沖洗、分化、返藍，梯度酒精脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察結果。以細胞質染成棕黃色或棕褐色為陽性反應，每張片子選取5個隨機視野(×20)，用Image J軟件分析陽性細胞率。

1.3.6IHC和TUNEL法檢測腫瘤細胞增殖率及凋亡率 用免疫組化法檢測Ki-67的表達情況；TUNEL的檢測按照試劑盒說明書具體操作步驟進行。以細胞核染成棕黃色或棕褐色為陽性反應，每張片子選取5個隨機視野(×20)，用Image J軟件分析增殖率/凋亡率。

2 結果

2.1 SAHA聯合厄洛替尼對H1975裸鼠移植瘤大小、瘤重及體質量的影響聯合組與對照組、SAHA組及厄洛替尼組比較，腫瘤大小及瘤重差異有統計學意義(F=7.58、8.59，P<0.05)，而SAHA組、厄洛替尼組與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。T/C≤60%且TGI≥40%(P<0.05)，提示SAHA和厄洛替尼聯用對H1975肺癌移植瘤有抑制作用。兩藥聯用Q值為1.86，提示SAHA和厄洛替尼聯用有協同作用。見圖1、表1。

圖1 各組裸鼠第21天腫瘤大小

分組體質量(g)0 d21 d腫瘤大小(mm3)0 d21 d相對腫瘤增殖率(%)瘤重(g)抑瘤率(%)對照18.0±0.319.4±0.6183±21 1 838±469100.00 2.41±1.020SAHA17.7±0.419.3±0.7183±17 1 669±428#90.81 2.11±0.69#12.45厄洛替尼18.3±0.320.0±0.6182±16 1 648±355#89.66 1.95±0.67#19.09聯合18.7±0.317.7±0.6183±17 1 061±205?57.73 1.10±0.30?54.36

與對照組比較：*P<0.05；與聯合組比較：#P<0.05

圖2 Western blot檢測各組腫瘤組織中PI3K/AKT/mTOR、MAPK/ERK信號通路相關蛋白的表達及相對表達量分析

A:Western blot檢測各組腫瘤組織中PI3K/AKT/mTOR、MAPK/ERK信號通路相關蛋白的表達；B:Western blot檢測各組腫瘤組織中p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p-ERK/ERK的相對表達量；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.001；與聯合組比較：#P<0.05，##P<0.001

2.2 Western blot檢測各組移植瘤腫瘤組織中PI3K/AKT/mTOR和MAPK/ERK信號通路相關蛋白的表達Western blot結果表明，SAHA聯合厄洛替尼在不影響AKT、mTOR、ERK總蛋白表達的情況下，可顯著下調p-AKT、p-mTOR、p-ERK的表達，與單藥組及對照組比較差異有統計學意義(F=8.64、25.19、46.12，P<0.05)，提示SAHA聯合厄洛替尼可抑制PI3K/AKT/mTOR和MAPK/ERK兩條信號通路中相關蛋白的活化。見圖2。

2.3 IHC檢測各組移植瘤腫瘤組織中p-AKT、p-mTOR和p-ERK的表達免疫組化結果表明，與對照組比較，單用SAHA或厄洛替尼對H1975腫瘤組織中p-AKT、p-mTOR、p-ERK的表達無明顯影響(P>0.05)，而SAHA聯合厄洛替尼卻能顯著抑制腫瘤組織中p-AKT、p-mTOR、p-ERK的表達(F=5.28、9.67、10.44，P<0.05)，且聯合組的抑制作用明顯優于單藥組。見圖3。

2.4 SAHA聯合厄洛替尼對H1975裸鼠移植瘤腫瘤細胞增殖及凋亡的影響HE染色結果顯示，對照組腫瘤組織以輕中度壞死為主，SAHA組和厄洛替尼組以中重度壞死為主，而聯合組以重度壞死為主，可見細胞呈不同程度皺縮、胞質致密、核染色質邊集，細胞核固縮、變性及裂解。各組移植瘤腫瘤細胞增殖率分別為:對照組(29.12±7.24)%，SAHA組(26.36±7.27)%，厄洛替尼組(27.15±3.40)%，聯合組(17.98±5.03)%；各組移植瘤腫瘤細胞凋亡率分別為:對照組(2.35±1.25)%，SAHA組(6.39±1.79)%，厄洛替尼組(6.44±5.07)% ，聯合組(12.15±5.43)%。聯合組與對照組、SAHA組及厄洛替尼組相比，增殖率及凋亡率的差異有統計學意義(F=5.44、8.67，P<0.05)。見圖4。

圖3 IHC檢測各組腫瘤組織中p-AKT、p-mTOR和p-ERK的表達及半定量分析×20

A:IHC檢測各組腫瘤組織中p-AKT、p-mTOR和p-ERK的表達; B:各組裸鼠腫瘤組織中p-AKT、p-mTOR、p-ERK陽性表達率；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.001；與聯合組比較：#P<0.05

3 討論

近年來肺癌的發生率和死亡率呈持續上升的趨勢，已躍居惡性腫瘤之首。腫瘤治療的三大傳統手段(手術、化療、放療)對于晚期肺癌療效甚微，分子靶向藥物EGFR-TKI的出現對NSCLC的治療具有里程碑的意義，然而無論近期療效如何，經TKI治療后的肺癌患者最終都會不可避免地出現耐藥而導致治療失敗或疾病進展。研究[10]表明獲得性耐藥中EGFR-T790M二次突變約占50%，c-Met基因擴增約占15%～20%，其他不明原因約占30%。H1975細胞株的EGFR含有L858R和T790M雙突變，L858R是EGFR第21號外顯子發生了點突變，使858位密碼子的亮氨酸置換為精氨酸，是TKI治療的敏感突變；T790M是EGFR第20號外顯子發生了錯義突變，使790位密碼子的蘇氨酸置換為甲硫氨酸，其中T790M突變是國際公認的一代EGFR-TKI獲得性耐藥機制。T790M突變導致側鏈空間結構增大，出現位阻效應，這種位阻效應阻礙了EGFR-TKI與EGFR的結合，同時導致EGFR與ATP親和力增加，引起下游信號通路的持續活化，從而導致耐藥的產生[11]。

圖4 各組裸鼠腫瘤組織大體形態結構變化及對增殖率和凋亡率的影響 ×20

A:各組裸鼠腫瘤組織大體形態結構變化及增殖和凋亡情況； B:各組裸鼠腫瘤組織Ki-67陽性表達率；C:各組裸鼠腫瘤組織TUNEL陽性表達率；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.001；與聯合組比較：#P<0.05

厄洛替尼通過競爭性地結合胞內EGFR-TK催化區域的Mg-ATP結合位點，抑制激酶的自身磷酸化，阻斷EGFR下游信號通路轉導，促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖，從而發揮抗腫瘤作用； HDACI是一類新型的抗腫瘤藥物，具有高效低毒的特點，其中SAHA是最具代表性的HDACI之一，體內外實驗[12]表明SAHA對EGFR突變的NSCLC細胞有抑制作用。本實驗建立了H1975肺癌裸鼠移植瘤模型，根據臨床前抗腫瘤藥效方法評價SAHA與厄洛替尼聯用的抗腫瘤藥效活性，結果表明SAHA聯合厄洛替尼可協同抑制H1975肺癌裸鼠移植瘤的生長，降低腫瘤大小和瘤重。免疫組化和TUNEL結果表明SAHA聯合厄洛替尼可協同抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡。Western blot和免疫組化結果表明SAHA聯合厄洛替尼可顯著下調p-AKT、p-mTOR、p-ERK的表達，提示兩藥聯用能同時抑制PI3K/AKT/mTOR、MAPK/ERK兩條信號通路中相關磷酸化蛋白的表達。

臨床上患者對EGFR-TKI耐藥的主要原因是EFRG下游信號通路磷酸化蛋白的持續活化[13]。EGFR的下游信號通路主要有兩條：PI3K/AKT/mTOR和MAPK/ERK，這兩條信號通路也是目前研究最為深入的。PI3K/AKT/mTOR、MAPK/ERK兩條信號通路能調節細胞的增殖、凋亡、分化、新陳代謝等過程，是細胞的關鍵生存信號通路, 與腫瘤的發生發展及化療耐藥性等相關。研究[14]表明，這兩條信號通路是相互作用的，抑制這兩條信號通路中的一條會導致另一條信號通路的級聯激活，而同時抑制兩條信號通路卻能更有效地起到抗腫瘤作用。本實驗結果同樣也證實了這一點，SAHA聯合厄洛替尼能同時抑制這兩條信號通路中相關蛋白的活化，抑制下游信號通路的轉導而逆轉EGFR-TKI耐藥。

綜上所述，SAHA聯合厄洛替尼可顯著抑制H1975肺癌裸鼠移植瘤的生長，作用機制可能與同時抑制PI3K/AKT/mTOR、MAPK/ERK兩條信號通路中相關蛋白的活化有關。SAHA聯合厄洛替尼能部分逆轉EGFR-TKI耐藥，顯著增強在H1975裸鼠移植瘤中的療效，可能作為靶向增敏劑。本實驗在體外細胞實驗的基礎上，在動物體內研究了SAHA聯合厄洛替尼的協同抑瘤作用及可能的作用機制，為臨床應用提供了一定的理論依據。