5F誘導肺癌A549細胞G2期阻滯及細胞凋亡并伴隨p53上調及Survivin下調

呂應年 梁言 葉華 劉義 吳科鋒 李立

(廣東醫科大學廣東天然藥物研究與開發重點實驗室，廣東 湛江 524023)

在中國，肺癌發病率及致死率均高于其他癌癥〔1〕。大約87%的肺癌為非小細胞肺癌(NSCLC)，大約70%的NSCLC確診時已是晚期，盡管治療手段已取得進步，但預后仍不佳〔2〕。Ent-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic-acid(簡稱5F)是草藥半邊旗(Pteris semipinnata L.，PsL)的提取物，無論在體內還是在體外都顯示出較好的抑癌效果并且毒副作用輕微〔3，4〕。本研究擬檢測5F對體外培養的NSCLC細胞株A549增殖活性的影響。

1 材料和方法

1.1細胞 人源NSCLC細胞A549，由本實驗室-80℃保存。

1.2藥品 5F干粉由本實驗室提供，采用丙二醇溶解并以蒸餾水稀釋，制成丙二醇體積分數是0.15、5F質量濃度是1 mg/ml的儲備液，然后除菌過濾、冷藏。實驗時，再以培養基稀釋至所需的5F濃度(丙二醇最終濃度≤0.012)。

1.3試劑 新生牛血清(購于Hyclone)；RPMI1640培養基干粉、MTT及碘化丙啶(PI)(購于Sigma)；胰蛋白酶(購于Amresco)；Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒(購于dojindo)；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)配制試劑盒、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、免疫印跡轉膜液、顯影定影試劑、發光液、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑、細胞裂解液、GAPDH單克隆抗體、Survivin抗體及辣根過氧化物酶標記二抗(購于碧云天)；p53抗體(購于Santa Cruz)。

1.4儀器 YJ-875細胞操作臺(購于蘇州凈化設備廠)；CO2恒溫細胞培養箱(購于Thermo)；垂直電泳儀(購于Bio-rad)；ELx800酶標儀(購于BIO-TEK)；流式細胞儀(購于Beckmancoulter)；普通光學倒置顯微鏡(購于Nikon)。

1.5細胞培養 在37℃、含5% CO2的飽和濕度培養箱內，培養A549細胞于含10%新生牛血清的RPMI1640培養液中。

1.6MTT法檢測癌細胞存活率 當A549細胞鋪滿培養瓶底面積80%時，采用胰酶剝離細胞；細胞計數并調整細胞濃度，于96孔細胞培養板內接種細胞，使每孔含有細胞2 000個。次日，以不同濃度5F處理細胞，然后培養細胞24、48或72 h；添加MTT(MTT終濃度為0.5 mg/ml)并繼續培養4 h，然后棄培養液，每孔加100 μl的二甲基亞砜(DMSO)，搖勻后再采用酶標儀檢測波長570 nm處的吸光度，計算癌細胞的存活率。另外，在5F處理24 h的時間點進行細胞形態學觀察。

1.7流式細胞儀檢測細胞周期 A549細胞鋪滿細胞培養瓶底面積80%時，以胰酶剝離細胞，并于6孔細胞培養板內接種細胞，保證每孔含細胞105個。次日，以不同濃度的5F處理細胞；24 h后，采用胰酶剝離細胞，離心后以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌；再離心后丟棄上清，采用70%的酒精固定細胞，置于4℃并過夜；離心后以PBS洗滌，丟棄上清，以50 μg/ml的PI染色，采用流式細胞儀并按試劑盒說明書檢測細胞周期。

1.8流式細胞術檢測細胞凋亡 A549鋪滿培養瓶底面積80%時，以胰酶剝離細胞，于6孔細胞培養板內接種細胞，保證每孔含細胞105個。次日，以不同濃度5F處理細胞。24 h后，采用流式細胞儀并按試劑盒說明書檢測細胞凋亡。

1.9免疫印跡檢測p53及Survivin蛋白表達 取對數生長期A549細胞接種于6孔細胞培養板。次日，以不同濃度5F處理細胞，培養24 h后收集細胞，并提取蛋白、測定濃度。進行SDS-PAGE，轉膜并采用脫脂奶封閉2 h，加p53(1∶200)或Survivin(1∶400)抗體，4℃孵化過夜；洗膜并添加二抗，室溫孵化2 h；洗膜后曝光并顯影，采用Quantity One軟件進行目標蛋白表達水平的分析。

1.10統計學分析 以SPSS 12.0軟件行單因素方差分析。

2 結 果

2.15F對A549增殖活性的影響 MTT結果表明，5F處理無論是24、48 h或72 h，在5～80 μg/ml范圍內均可顯著抑制A549細胞增殖，且抑制效果隨著5F濃度的增加而增強，呈劑量依賴關系。同時，在5F濃度相同的情況下，隨著處理時間延長，其抗癌效果也增強，呈時間依賴關系，見圖1。

2.25F對A549細胞形態學影響 在空白對照組(5F 0 μg/ml)，A549細胞增殖迅速并密布細胞培養瓶底部，雖然細胞過多導致相互擠壓但無細胞脫壁現象發生。隨著5F濃度提高，A549細胞增殖活性逐漸下降且貼壁能力逐漸降低，且有細胞脫落懸浮，并可見部分細胞體積變小、變圓。見圖2。

與0 μg/ml比較：1)P<0.01，2)P<0.001圖1 5F對細胞存活的影響

圖2 5F對細胞形態學的影響(×100)

2.35F對A549細胞周期進程的影響 5F處理能夠導致A549細胞周期發生改變，具體表現為G2期細胞比例顯著增多，且該G2期阻滯作用隨著5F濃度的增加而增強即呈劑量依賴關系(P<0.001)，而20 μg/ml及40 μg/ml的5F處理甚至能夠使G2期細胞比例提高數倍。見表1。

2.45F對A549細胞凋亡水平的影響 5F處理24 h可顯著提高A549細胞凋亡發生水平，且呈劑量依賴關系(P<0.001)，特別是在5F濃度為20 μg/ml及40 μg/ml時，A549細胞凋亡率均出現了數倍的大幅度上調，提示5F具有誘導A549細胞發生凋亡的活性。見表1。

2.55F對A549細胞內p53及Survivin蛋白表達的影響 5F處理24 h導致A549細胞內p53蛋白表達顯著提高，即隨著5F濃度的增加p53蛋白表達面積及灰度逐漸擴大并增強且呈劑量依賴關系(P<0.001)，而Survivin蛋白表達則隨著5F濃度的增加而逐漸下調并呈劑量依賴關系(P<0.001)，見表1，圖3。

表1 5F對A549細胞周期、細胞凋亡及p53、Survivin蛋白表達的影響

與0 μg/ml 5F組比較：1)P<0.01，2)P<0.001；與10 μg/ml 5F組比較：3)P<0.001

圖3 5F對p53及Survivin蛋白表達的影響

3 討 論

本研究結果表明，5F可顯著抑制NSCLC細胞株A549的增殖活性，并且呈劑量、時間依賴關系，提示5F具有較好的抗癌效果。

細胞周期失控及細胞凋亡的逃避是癌細胞標志性特征〔5〕。因此，阻斷細胞周期進程可能是一個有效抗癌策略。5F已被證明能夠阻滯結腸癌細胞C26、鼻咽癌細胞CNE-2Z、肺癌細胞NCI-H23及CRL-2066于G2期〔3，4，6〕。與上述報道相似，本研究顯示5F可以誘導A549細胞發生G2期阻滯。P53激活能夠導致細胞發生G2期阻滯，其機制在于p53靶基因p21可通過抑制cyclin B/Cdc2阻斷細胞周期進程；另外，其他的p53靶基因如14-3-3σ也可能參與阻斷G2期轉換〔7〕。鑒于此，本文檢測了A549細胞內p53蛋白表達，以期進一步調查5F介導的細胞G2期阻滯發生原因。結果顯示，5F處理能夠顯著提高A549細胞內p53蛋白表達，并呈劑量依賴關系，表明5F誘導的細胞周期G2期阻滯可能涉及p53激活。

先前的報道顯示，一些抗癌劑如順鉑能夠抑制G2期進程并伴隨細胞凋亡的發生〔8〕。通過細胞凋亡誘導腫瘤細胞死亡是抗癌劑的主要機制。在本研究中，Annexin V-FITC染色結果顯示5F誘導了A549發生細胞凋亡，該結果與我們先前研究5F誘導其他癌細胞發生凋亡所獲結果一致〔3,4,6,9～11〕。Survivin是凋亡抑制蛋白(IAP)家族重要成員之一，幾乎在所有的人類腫瘤細胞中大量表達，但在大多數的、已分化的正常組織中卻罕有表達，因此被認為是癌特異性標志物〔12〕。Survivin能夠通過眾多的信號轉導通路，干擾細胞凋亡進程、促進腫瘤傳播，并賦予腫瘤細胞治療逃避的特性。在本研究中，5F處理導致Survivin蛋白表達下調，提示5F誘導的細胞凋亡可能與Survivin抑制有關。此外，5F誘導的p53上調也可能參與了上述細胞凋亡的發生，因為p53除了調控細胞周期進程外，還能夠通過轉錄依賴方式或非轉錄依賴方式誘導細胞凋亡〔7〕。

綜上所述，5F能夠顯著抑制體外培養的肺癌細胞A549增殖，該抑制效果與細胞周期G2期阻滯及細胞凋亡有關，并可能涉及p53蛋白上調及Survivin蛋白下調。