PBX3基因調控p38MAPK信號對肝癌細胞生長及5-氟尿嘧啶化療敏感性的影響

徐卓 張萌 張志磊 賈聿明 王超 彭利

(河北醫科大學第四醫院肝膽外科，河北 石家莊 050011)

全球范圍內的肝癌發病率及死亡率呈逐年上升趨勢〔1〕。肝癌的發生發展與癌基因、抑癌基因等的異常表達密切相關。前B細胞白血病同源盒基因(PBX)3與腫瘤發生發展密切相關。PBX3表達量與前列腺癌惡性程度呈正相關〔2〕；PBX3可逆轉Let-7c對結腸癌生長抑制作用〔3〕；結直腸癌中PBX3高表達，可通過激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/細胞外信號調節激酶(ERK)信號誘導細胞侵襲及遷移〔4〕。miR-33a-3p可通過靶向抑制PBX3降低肝癌細胞的侵襲及遷移能力〔5〕。5-氟尿嘧啶(5-FU)是一種常用的廣譜抗腫瘤藥物，通過影響DNA復制，參與細胞周期調控，目前已發現5-FU可協同藥物、分子靶向等用于肝癌的治療〔6〕。本研究通過干擾PBX3表達，觀察其對肝癌細胞的增殖活力、凋亡和對5-FU化療敏感性的影響，并進一步研究其分子機制。

1 材料方法

1.1細胞及主要試劑和儀器 人正常肝細胞HL-7702及肝癌Huh7、HepG2、MHCC97H、SMMC7721細胞均購自美國ATCC。RPMI1640培養基、雙抗、FBS、胰蛋白酶均購于美國Gibco；Bradford蛋白定量試劑盒購自北京天根生化；噻唑藍(MTT)溶液購自美國Sigma；膜聯蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)試劑盒購自上海博古生物；PBX3、細胞增殖核抗原(PCNA)、Bax、p38MAPK、磷酸化(p)-p3 8MAPK及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體均購自美國Abcam；流式細胞儀購自美國BD；酶標儀購自上海賽默生物。

1.2細胞培養 采用含10%FBS及雙抗的RPMI1640細胞培養液培養HL-7702、Huh7、MHCC-97H、HepG2和SMMC7721細胞，細胞培養箱條件設定為CO2體積分數5%、濕度分數95%和溫度37℃。2～3 d換液1次，待細胞生長密度超過80%后，以胰酶消化傳代。選取生長良好且處于對數期的細胞用于實驗研究。人正常肝細胞HL-7702為對照細胞，Western印跡檢測肝癌Huh7、HepG2、MHCC97H、SMMC7721細胞中PBX3的蛋白表達。

1.3siRNA轉染 依據siRNA設計原則設計針對PBX3的特異性siRNA(si-PBX3組)，同時設計不具有干擾作用的siRNA(NC組)，均由上海吉瑪合成。以2.5×104/ml細胞密度接種生長至對數期的SMMC7721細胞于6孔板，每孔2 ml細胞懸液，觀察到細胞達90%以上生長融合時，根據轉染試劑脂質體2000的說明書步驟，將制備的Lip2000與siRNA混合物加入6孔板，僅加入脂質體的為空白對照組，培養箱內孵育6 h后換液繼續培養48 h，收集細胞，進行后續實驗。

1.4細胞活力檢測 SMMC7721細胞分為4組處理：NC組、si-PBX3組、5-FU組和si-PBX3+5-FU組。NC組和si-PBX3組分別轉染不具有干擾作用的siRNA及靶向抑制PBX3的siRNA，5-FU組用不具有干擾作用的siRNA及10 μmol/L的5-FU處理細胞，si-PBX3+5-FU組用靶向抑制PBX3的siRNA及10 μmol/L的5-FU處理細胞。將SMMC7721細胞按照每孔3×103個密度接種于96孔板，孵育24 h后，根據上述分組處理細胞。處理48 h后，收集NC組、si-PBX3組、5-FU和si-PBX3+5-FU細胞，加入MTT溶液(5 mg/ml)，每孔20 μl，常規孵育4 h，加150 μl的二甲基亞砜(DMSO)溶液在每孔細胞中，緩慢震蕩混勻10 min，490 nm，酶標儀測定各組吸光度值(A值)，每組設置5個復孔，實驗重復3次。

1.5細胞凋亡檢測 處理48 h后，收集NC組、si-PBX3組、5-FU組和si-PBX3+5-FU組細胞，以預冷的PBS洗滌后，胰蛋白酶消化，調整細胞密度為4×105個/ml，以500 μl的1×結合緩沖液重懸細胞后，加入5 μl的AnnexinV-FITC染色液在細胞懸浮液中，避光室溫孵育15 min，再加10 μl的PI染色液，避光室溫孵育5 min，加300 μl的1×結合緩沖液，1 h內上流式細胞儀檢測NC組、si-PBX3組、5-FU組和si-PBX3+5-FU組細胞的凋亡率。實驗重復3次。

1.6Western印跡法 處理48 h后，收集NC組、si-PBX3組、5-FU組和si-PBX3+5-FU組細胞，加入RIPA裂解液提取各組SMMC7721細胞的總蛋白，并采用Bradford法對總蛋白定量。按照每孔道40 μg上樣量將蛋白樣品上樣中十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)中，電泳分離結束后，電轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，浸入5%的脫脂奶粉中封閉1 h后，加1∶1 000稀釋的PCNA、Bax、PBX3、p38MAPK和p-p38MAPK抗體，4℃孵育過夜。再加入1∶2 000稀釋的二抗(辣根過氧化物酶標記)，室溫孵育2 h，電化學發光(ECL)顯色。凝膠系統掃描分析。實驗重復3次。

1.7統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1PBX3基因在肝癌細胞中的表達 HL-7702、Huh7、HepG2、MHCC97H、SMMC7721細胞中PBX3蛋白相對表達量分別為：(0.053±0.008)、(0.226±0.020)、(0.287±0.027)、0.509±0.048)、(0.674±0.056)。肝癌細胞中PBX3蛋白表達均顯著高于HL-7702細胞(P<0.05)。見圖1。

2.2各組PBX3蛋白表達結果 PBX3在si-PBX3組中的表達(0.071±0.010)顯著低于空白對照組(0.292±0.030，P<0.05)，而在NC組的表達(0.320±0.032)與空白對照組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖1 Western印跡檢測PBX3蛋白表達

圖2 各組PBX3蛋白表達

2.3各組細胞活力比較 si-PBX3組和5-FU組細胞活力均顯著低于NC組(P<0.05)，而si-PBX3+5-FU組細胞活力顯著低于si-PBX3組和5-FU組(P<0.05)。見表1。

2.4各組細胞凋亡率比較 si-PBX3組和5-FU組細胞凋亡率均顯著高于NC組(P<0.05)，而si-PBX3+5-FU組細胞凋亡率顯著高于si-PBX3組和5-FU組(P<0.05)。見表1、圖3。

2.5各組p38MAPK、p-p38MAPK、PCNA、Bax蛋白表達比較 si-PBX3組和5-FU組細胞PCNA及p-p38MAPK蛋白表達均顯著低于NC組，Bax蛋白表達顯著高于NC組(P<0.05)，而si-PBX3+5-FU組PCNA及p-p38MAPK蛋白表達均顯著低于si-PBX3組和5-FU組，Bax蛋白表達顯著高于si-PBX3組和5-FU組(P<0.05)。4組p38MAPK蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。見表1、圖4。

表1 各組細胞活力、凋亡率及PCNA、Bax、p38MAPK和p-p38MAPK蛋白相對表達量比較

與NC組比較；1)P<0.05；與si-PBX3+5-FU組比較：2)P<0.05

圖3 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率

圖4 PBX3 siRNA或5-FU對SMMC7721細胞p38MAPK信號通路的影響

3 討 論

如何有效增強化療效果、提高化療藥物敏感性及減輕化療引起的不良反應成為腫瘤治療研究一個熱點。PBX3屬于含有三氨基酸突出環(TALE)的PBX家庭成員的同源基因，可與Hox蛋白互作，增強Hox蛋白結合DNA的親和力，進而調節下游基因的轉錄。作為原癌基因PBX1的同源基因， PBX3與腫瘤發生發展存在潛在關系。研究表明，PBX3過表達可增加胃癌細胞增殖能力，上調公認的細胞增殖標記PCNA表達，并促進細胞的侵襲能力〔7〕。PBX3與同源盒基因(HOX)A9可協同促進白血病的生成，沉默PBX3的表達可抑制正常急性髓系白血病細胞生長及增加化療敏感性〔8〕；以上研究結果表明，在人類腫瘤中PBX3作為癌基因起作用。葛根素聯合5-FU治療SMMC7721肝癌細胞有協同作用，并可增強5-FU對肝癌細胞作用的敏感性〔9〕；RNA干擾沉默增強子同源物(EZH)2基因可以增強Bel/FU細胞對5-FU的敏感性〔10〕。PBX3對肝癌細胞生物學特性的影響及是否增強肝癌5-FU的敏感性還未明確。

RNA干擾(RNAi)是一種新的在轉錄后阻斷基因表達的技術，由雙鏈RNA介導，具有高效性、特異性，與其他基因腫瘤治療方法比較，RNAi技術呈現出更高的特異性及更強的抑制目的基因表達特性，因此，RNAi技術已用于基因功能研究、基因治療等方面〔11,12〕。本研究結果顯示，PBX3 siRNA及5-FU均可抑制SMMC7721細胞活力，誘導細胞凋亡，聯合對細胞活力抑制及凋亡促進作用更明顯。這提示PBX3 siRNA可抑制肝癌細胞生長及增加5-FU肝癌化療敏感性。

MAPK信號是細胞內一條重要的信號轉導途徑，在大多數細胞內存在，參與細胞增殖、凋亡、周期及分化等的調控，在真核細胞中，已確定有ERK、JNK、p38MAPK和ERK5 4條MAPK信號通路，與多種人類腫瘤的發生發展密切相關，在乳腺癌、食管癌、肺癌等腫瘤中呈現持續激活表達〔13～15〕。抑制p38MAPK信號可降低肝癌細胞生長〔16〕。PCNA是常用的細胞增殖標記物〔17〕，Bax是Bcl-2家族促凋亡蛋白，在包括肝癌在內的多種腫瘤中表達降低〔18,19〕。本研究結果顯示，PBX3 siRNA及5-FU均可下調p-p38MAPK及PCNA表達，上調Bax表達。這提示PBX3 siRNA抑制肝癌細胞生長及5-FU化療增敏可能與下調p38MAPK信號有關。

綜上，PBX3基因表達的抑制可降低肝癌細胞活力，誘導細胞凋亡，增強肝癌5-FU化療敏感性，機制可能與下調p38MAPK信號通路有關。本研究可能為肝癌分子靶向治療及5-FU肝癌化療增敏提供了一定的理論基礎。