硫化氫通過上調神經調節蛋白1/ErbB2抑制阿霉素誘導的大鼠心肌纖維化

聶連桂 劉茂軍 陳堅 吳倩 譚文婷 劉盛權 褚春 唐芬 龍俊蓉 楊軍

(南華大學 1附屬第一醫院心血管內科，湖南 衡陽 421000;2附屬第二醫院藥劑科)

阿霉素作為一種高效的蒽環類廣譜抗腫瘤藥物，隨著上市后在臨床的廣泛應用已被證明對人體具有不可逆的時間和劑量依賴性心臟毒性，可導致類似于擴張型心肌病的病變。而心肌纖維化不僅是擴張型心肌病主要的病理變化之一，也是阿霉素誘導擴張型心肌病的病理生理過程中的關鍵環節〔1，2〕。但目前對于阿霉素誘導心肌纖維化發生的具體機制尚不明確，有研究發現神經調節蛋白(NRG)1/ErbB2信號轉導通路與保護心肌、改善心肌纖維化等過程關系密切〔3，4〕，心肌細胞中NRG1可通過激活被稱為ErbBs蛋白的受體酪氨酸激酶〔表皮生長因子(EGF)受體的經典成員〕進行一系列的信號轉導從而參與心肌纖維化過程〔5〕。硫化氫(H2S)作為一種新型的氣體信號分子，其在心血管系統中參與一系列的生物保護效應，已有研究表明H2S在動物模型中具有保護心肌，改善心肌纖維化的作用〔6，7〕。但目前對于H2S是否具有改善阿霉素誘導的大鼠心肌纖維化的作用及其內在調控機制均尚不明確。本研究觀察H2S對阿霉素誘導的大鼠心肌纖維化及NRG1、ErbB2蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 雄性成年SD大鼠40只，體重取180～200 g，購于長沙斯萊克動物實驗中心；飼養于溫度適宜(22±2)℃的恒定環境中，晝夜各12 h，大鼠均可自由進食，飲水；分籠飼養，定期消毒。

1.2主要實驗試劑 阿霉素購于美侖生物公司；NRG1和ErbB2一抗、抗兔二抗購于中國武漢博士德生物有限公司；GAPDH一抗(兔源)購于中國晶欣生物公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒和細胞裂解液購于中國碧云天生物公司；硫氫化鈉(NaHS,H2S供體)購于美國Sigma公司；Masson染色試劑盒購于中國邁新生物技術開發公司。

1.3動物模型的建立 將40只SD大鼠置于恒溫環境下適應性飼養1 w后隨機分為對照組、模型組、H2S模型組、H2S對照組，每組各10只。模型組和H2S模型組采用2 w分6次腹腔注射阿霉素，劑量為3 mg/(kg·次)(注射前用生理鹽水稀釋至0.5 mg/ml，造模2 w總劑量為18 mg/kg)造模，對照組及H2S對照組予以同等劑量的生理鹽水腹腔注射共6次。2 w后，H2S模型組及H2S對照組給予NaHS〔56 μmol/(kg·d)，溶于1 ml生理鹽水中，使用前新鮮配制〕腹腔注射，對照組和模型組使用同等劑量的生理鹽水腹腔注射。建模8 w后，將所有大鼠麻醉后處死。

1.4Masson染色觀察心肌纖維化沉積 取各組左室心肌組織，置于10%中性甲醛溶液中固定，石蠟包埋，制成切片〔(3±1)mm〕，嚴格按照說明書步驟開始Masson染色；隨后在40×10倍鏡下選取不同視野，每個標本選取5個視野，觀察染色區域的膠原纖維染色面積，比較各組膠原沉積情況。

1.5Western印跡檢測心肌組織中NRG1和ErbB2蛋白的表達 取各組左室心肌組織，提取蛋白后經BCA比色法定量；取蛋白樣本經99℃煮10 min；嚴格按照說明書比例配置10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離膠置于電泳緩沖液中電泳；取目的條帶進行轉膜；Tween-20 Tris-鹽酸緩沖液(TBST)封閉；經NRG1和ErbB2及GAPDH一抗(稀釋度為1∶1 000)37℃孵育后置4℃過夜；經TBST洗膜后用辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗兔二抗(稀釋度為1∶2 000)37℃孵育后；再經TBST洗膜；電化學發光(ECL)顯影；曝光，掃描；經Image J軟件對靶蛋白條帶進行光密度分析。取GAPDH一抗為內參，將目的條帶與內參灰度比值分別表示NRG1和ErbB2蛋白表達水平。

1.6統計方法 采用SPSS18.0軟件進行方差齊性檢驗及單因素方差分析。

2 結 果

2.1大鼠存活情況 8 w后，共存活33只SD雄性大鼠，其中對照組10只、模型組6只、H2S模型組7只、H2S對照組10只。

2.2各組心肌纖維化沉積 鏡下觀察膠原纖維染呈藍色。模型組心肌纖維沉積較對照組顯著增加(P<0.05)；H2S模型組心肌組織纖維沉積較模型組顯著減少(P<0.05)。H2S對照組與對照組相比無明顯差異。見圖1。

圖1 各組心肌纖維化沉積(Masson染色，40×10)

2.3各組心肌組織NRG1蛋白表達 與對照組(0.95±0.019)比較，模型組心肌組織NRG1蛋白表達(0.72±0.116)顯著降低(P<0.05)；H2S模型組心肌組織NRG1蛋白表達(1.02±0.045)較模型組顯著升高(P<0.05)；對照組與H2S對照組NRG1的表達(1.03±0.047)無明顯差別(P>0.05)。見圖2。

2.4各組心肌組織ErbB2蛋白表達 與對照組(0.91±0.019)比較，模型組心肌組織ErbB2蛋白表達(0.61±0.115)顯著降低(P<0.01)；H2S模型組心肌組織ErbB2蛋白表達(0.89±0.015)較模型組顯著升高(P<0.01)；對照組與H2S對照組ErbB2表達(0.80±0.054)無明顯差別(P>0.05)。見圖2。

圖2 各組NRG1和ErbB2蛋白表達水平

3 討 論

阿霉素作為一種高效的蒽環類抗腫瘤藥物，通過與拓撲異構酶Ⅱ結合，可破壞DNA的三級結構，抑制RNA和DNA的合成，從而發揮其抗腫瘤效應。然而，阿霉素抗腫瘤治療的同時在一定程度上也對正常細胞，尤其是心肌細胞具有極強的殺傷作用〔8〕。有實驗證明阿霉素可以導致心肌細胞凋亡〔1〕，而心肌細胞凋亡可導致心臟成纖維細胞增生并轉化為肌成纖維細胞，使細胞外基質沉積增加，從而發生心肌纖維化〔9〕。本研究與文獻〔9〕報道類似，說明采用腹腔注射阿霉素可導致大鼠明顯的心肌纖維化。研究顯示氧化應激、自身免疫等可能參與阿霉素導致心肌纖維化的發生機制，但具體的調控機制目前尚不十分明確〔10〕。NRG1/ErbB系統是一種調節心臟功能和適應的內皮控制的旁分泌系統。NRG1是一類含有EGF樣結構域的神經營養和腫瘤抑制因子，廣泛分布于中樞神經系統和心肌細胞中。NRG1的EGF樣結構域與受體ErbB蛋白結合并激活受體的酪氨酸激酶活性，從而觸發下游信號通路，激活一系列細胞內生物學級聯反應。NRG1受體包括 ErbB2、ErbB3及ErbB4〔3〕，成熟心肌細胞中表達ErbB4和ErbB2，NRG1與ErbB4高親和力捆綁，在心肌細胞中NRG1優先與ErbB2發生二聚反應，進而通過跨膜螺旋結構和細胞內的激酶域活化發生信號轉導〔8〕。NRG1從心臟微血管內皮細胞釋放，通過在心肌細胞中表達的ErbBs作為旁分泌因子調節心臟發育和應激反應。研究顯示NRG1/ErbB信號轉導通路參與心肌纖維化發生機制〔11，12〕，也有研究表明，心臟中高表達NRG1可以保護心肌細胞，而阿霉素能明顯減少 NRG和ErbB表達〔13〕。本研究提示NRG1/ErbB2信號通路可能參與阿霉素導致的心肌纖維化調控機制。

H2S分子作為一種具有廣泛生理功能的氣體信號分子，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用，已有文獻闡述了H2S可通過保護線粒體功能、降低內質網應激反應、抑制炎性反應等機制減少心肌細胞凋亡從而發揮心肌保護作用〔14〕。而H2S對心肌纖維化的改善作用已在糖尿病心肌病、甲狀腺功能亢進性心肌病等多個模型中被證明〔6，15〕。同時，研究發現NRG1/ErbB2信號通路參與多種病理生理過程，與慢性心力衰竭、急性心肌梗死等多種心血管疾病的發生發展密切相關〔3，4〕。在糖尿病心肌病等以心肌纖維化為病理改變為基礎的心肌病模型中已證明，NRG1/ErbB信號系統在維持心功能及逆轉心肌重塑中發揮關鍵性作用〔16〕。本研究提示H2S改善阿霉素誘導的大鼠心肌纖維化的機制可能與上調NRG1和ErbB2的表達有關。提示H2S可能通過上調NRG1/ErbB2通路抑制阿霉素誘導的心肌纖維化，但其具體信號調控機制仍需進一步研究。