多巴脫羧酶參與調解無脊椎動物神經內分泌免疫系統的研究進展

王凱 李博 于曉東 劉睿哲 藺思函 杜杰 沈秀麗 杜志強

（1. 內蒙古科技大學生命科學與技術學院，包頭 014010；2. 內蒙古科技大學圖書館，包頭014010）

自然界中，為了抵御外界病原體的入侵，無脊椎動物發育形成了一套完整的先天免疫防御系統。其中，多巴脫羧酶作為無脊椎動物先天免疫應答中的一種關鍵酶，不僅參與免疫系統的調節，同時，它催化生成的多巴胺等神經遞質在神經內分泌系統中也起到了重要作用，是研究無脊椎動物神經內分泌免疫系統的理想材料。多巴脫羧酶在自然界中廣泛存在，針對多巴脫羧酶展開的研究也十分豐富，然而，基于此國內外對淡水小龍蝦多巴脫羧酶的文獻報道還是十分稀少，這對我們深入探索小龍蝦的神經內分泌免疫系統造成了困難。在我國，淡水小龍蝦（Procambarus clarkii）屬于甲殼類動物，是一種重要的水產經濟蝦類，因其肉質鮮美、營養豐富而深受大眾的喜愛。近些年來，淡水小龍蝦因受到病原菌的感染，進而導致其養殖產量下降。細菌性疾病是淡水小龍蝦的主要病因，因此探究小龍蝦抵御細菌的免疫機制是目前亟待解決的重要科學問題。而小龍蝦多巴脫羧酶的研究可以進一步為其神經內分泌免疫系統的探索提供科學依據，也為無脊椎動物多巴脫羧酶的研究作出重要補充。

1 神經內分泌免疫系統

一直以來，在先天免疫領域研究的免疫學問題，從整體研究免疫系統與神經內分泌系統的相互作用在無脊椎動物中并不多見。神經系統、內分泌系統和免疫系統組成的神經內分泌免疫（Neuro-endocrineimmune regulatory system，NEI）系統是一個協調統一的整體［1］。它參與的信號識別、信號轉導、免疫應答等相關生物學過程，在維持生物體的內環境穩態、增強環境適應性、提高免疫力方面發揮著重要的作用。近幾十年，科研工作者為探索無脊椎動物整個免疫系統中不同基因之間的協調作用，進行了大量的實驗研究。例如，劉曉玲等［2］對櫛孔扇貝的Foxl 2蛋白進行了原核表達、純化及多克隆抗體制備；在長牡蠣中RIG-I樣受體（RIG-I like receptors，RLRs）識別并結合病毒后，通過與線粒體膜上的VISA蛋白結合，最終激活轉錄因子NF-κB和IRF3/7等，啟動免疫反應［3］；通過研究多肽對凡納濱對蝦生長、消化酶和免疫酶活力的影響，證明了添加合適比例的多肽可提高對蝦生長率，加強對蝦的免疫能力［4］。越來越多的實驗結果表明，今后對NEI系統的探索將引領我們在生命科學的道路上走得更遠。

在脊椎動物中，神經內分泌免疫調節是由下丘腦、垂體和內分泌腺組成的整體［5］。研究表明，高等脊椎動物神經系統調節免疫系統主要分為以下4個步驟：機體受到外界的刺激后，充分激活免疫應答；神經元會被一些細胞因子刺激，釋放神經遞質；神經遞質一方面參與免疫應答，另一方面將信號傳入中樞神經系統；當免疫反應達到閾值時，中樞神經系統會分泌神經遞質和激素下調免疫，終止免疫應答。自從1955年首次報道證明了下丘腦和垂體的內在聯系，近年來關于脊椎動物NEI系統的探索逐步增多?？茖W家們對NEI系統的基礎研究越豐富，越有助于我們探究它的分子作用機制。已有研究證明：免疫細胞的產物能夠影響中樞神經系統的功能、激素的分泌、神經性疾病的發生和內分泌系統的紊亂。反之，激素或神經遞質也能夠直接調控免疫細胞的功能、炎癥反應的結果以及自免疫病和感染性疾病的發生［6］。

自然界中，低等生物與高等生物的進化大部分都遵循著相同的法則。因而，在進化的過程中也有許多保守的細胞因子及作用機制會一直沿用至今。研究發現，無脊椎動物的神經內分泌系統在結構組成上相對簡單，它們擁有與脊椎動物類似甚至相同的免疫效應分子。包括阿黑皮素原（Pro-opiomelanocortin，POMC）、細胞因子（腫瘤壞死因子TNF、白細胞介素IL）、促腎上腺皮質激素（Adrenocorticotropic hormone，ACTH）等。此外，本實驗室已進行的小龍蝦轉錄組測序結果分析顯示，其具有白介素增強子的結合因子和腫瘤壞死因子受體相關的因子，也具有與腫瘤形成相關的Wnt信號通路的多種重要成分［7］。功能研究證明，它們與高等動物中的同源分子相同，都具有參與免疫調控和神經內分泌的作用。這證明了在無脊椎動物中，免疫系統的正常工作也是通過神經內分泌系統的有效調節來調控的。例如，在軟體動物中，NO系統能夠抑制血淋巴細胞的凋亡，增強血細胞的吞噬能力并提升血淋巴上清的抗菌活性［8］。

無脊椎動物在自然界中分布廣泛，說明其具有極強的環境適應能力，而這與NEI 系統的調控密不可分。深入了解其神經內分泌免疫系統的特性，對于全面認識無脊椎動物乃至整個生物界免疫系統的組成和分子機制都具有重要意義。近十幾年來，對于無脊椎動物NEI系統的關注越來越高。尤其是在軟體動物中，蔣秋芬［9］指出，免疫刺激下，貝類兒茶酚胺能系統通過NE-α/β-AR-cAMP/Ca2+途徑調控NO系統的活性水平；有研究發現，去甲腎上腺素可能通過與特定的血細胞受體作用，抑制海鞘血細胞NO的生成［10］。雖然對于無脊椎動物NEI系統的研究起步較晚，但經過科研工作者們的不斷努力，目前，在軟體動物中，已經先后鑒定到了兒茶酚胺系統、膽堿系統、腦啡肽系統、NO系統和氨基酸系統等NEI系統。

在眾多的NEI系統中，兒茶酚胺（Catecholamines，CAs）系統是NEI系統的典型代表之一。生物體內具有活性的兒茶酚胺包括多巴胺（Dopamine，DA）、去甲腎上腺素（Norepinephrine，noradrenaline，NE）和腎上腺素（Epinephrine，adrenalin，E）［11］。經過本實驗室研究結果證明，在小龍蝦兒茶酚胺生成代謝通路中（圖1），多巴脫羧酶（Dopa decarboxylase，DDC）是催化生成多巴胺的關鍵酶，它直接調控DA等神經遞質的表達水平，間接影響神經內分泌系統的調節。除此之外，DDC也參與了小龍蝦等無脊椎動物的先天免疫應答，具有重要的研究價值和意義。

圖1 無脊椎動物兒茶酚胺生成代謝通路

2 多巴脫羧酶

長久以來，科學家們苦于NEI系統的結構組成過于復雜，囊括免疫、神經和內分泌系統。在摸索這三者之間的聯系時，有時候耗時耗力也無法做到完整的闡述。為了解決這一難題，我們提出一個取巧的辦法：尋找，探索一種在NEI系統中起連接作用的關鍵因子，如多巴脫羧酶。DDC作為無脊椎動物先天免疫系統中的一個重要成員，在發揮免疫防御功能上有著關鍵作用，具有潛在的研究意義。其次，無論是在高等動物還是低等動物中，DDC既是免疫應答的重要組成部分，也是神經內分泌系統的重要參與者，是我們探索無脊椎動物NEI系統的一把“新鑰匙”。

2.1 多巴脫羧酶的研究現狀

多巴脫羧酶也被稱為色氨酸脫羧酶（Tryptophane decarboxylase，AAD），對芳香族左旋氨基酸具有強烈脫羧作用。它最早發現于高等動物的腎組織，能起到促進腎上腺素合成的作用。DDC在生物體內分布較廣，參與各種各樣的生物學過程并發揮著關鍵作用。如在哺乳動物［12］中，人們發現DDC是黑色素合成途徑中重要的酶。在昆蟲［13］中，DDC能夠調控昆蟲的生長發育過程。在植物［14］中，DDC還能合成芳香生物堿，該物質是藥物活性分子的前體物質。除此之外，DDC也是某些微量氨基酸合成過程中的限速酶，在內源性中樞神經遞質生成中起重要作用，該酶可分別催化L-多巴和L-五羥色胺酸合成DA和五羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）。

迄今為止，科學家們對于DDC的探索大多數集中在脊椎動物這類高等動物中：張緣緣［15］等對人源DDC進行了表達、純化以及高通量抑制劑篩選模型的建立；崔婷等［16］研究了DDC異常表達對大鼠抑郁行為的影響。而在低等無脊椎動物中，針對DDC的研究也尚未深入：徐秋雯［17］研究了蟲酰肼及Methoprene對亞洲玉米螟幼蟲DDC基因表達的影響；汪慧娟等［18］對異色瓢蟲DDC基因序列進行了低溫誘導表達分析。與此相對比，小龍蝦多巴脫羧酶的研究還沒有文獻報道，甚至連基礎性的基因克隆與蛋白純化的研究也不是很多，是無脊椎動物DDC領域研究的一塊空白。因此，探索小龍蝦DDC的功能活性與理化性質是必要的。

2.2 多巴脫羧酶的分子結構

為了摸索小龍蝦DDC蛋白的功能活性，研究DDC的分子結構是十分重要的。關于小龍蝦DDC蛋白的分子結構的文章至今未曾有人報道，我們只能借鑒無脊椎動物，如昆蟲DDC蛋白的相關文獻進行后續實驗探索。

DDC屬于轉氨酶的α-家族，是一個結合磷酸吡哆醛（Pyridoxine phosphate，PLP）的二聚體分子，分子量約為50 kD［19］。科學研究證明，它的生物學機制大部分是通過其輔因子PLP來進行多種生物學反應，包括脫羧反應、脫氨基作用，半氨基轉移以及環化反應。目前，人源DDC蛋白的分子結構已經被闡明［20］。結果表明，DDC整體結構顯示了該酶的組織活性位點，以典型的折疊式磷酸吡哆醛結合酶的方式排列。

在昆蟲中，科學家以斜紋夜蛾為研究材料，對斜紋夜蛾多巴脫羧酶基因的DNA序列及其編碼的蛋白質序列進行了生物學分析［21］。得出以下結果：無脊椎動物的DDC氨基酸序列具有極高的同源性。通過SWISS-MODEL在線工具進行建模，預測DDC三維結構（圖2）。證明了斜紋夜蛾與果蠅屬的多巴脫羧酶空間結構高度相似，這對我們探索小龍蝦DDC的分子結構打開思路?？梢圆孪?，小龍蝦DDC的功能結構域或許也比較保守。

圖2 SWISS-MODEL預測的斜紋夜蛾DDC三維結構

圖3 DDC催化的L-芳香族氨基酸脫羧反應

2.3 多巴脫羧酶的催化機制

DDC的作用主要在于引發脫羧反應，反應底物包括大部分芳香族氨基酸及α-甲基衍生物，甚至它可以在多種催化反應中調節底物或產物的濃度水平?？蒲泄ぷ髡哒J為，它的這種催化機理主要取決于PLP的相關反應（圖3）［22］。

從DDC的催化機理流程圖可以看出，它催化L-多巴生成DA的過程大致分為4步：第1步，以PLP和Lys-303氨基酸殘基結合，形成內部醛亞胺結構；第2步，結合L-多巴后，從內部醛亞胺結構轉化為外部醛亞胺；第3步，脫羧反應形成中間體——醌；第4步，醌在α-碳原子上被質子化，形成DA。DDC的催化機制大致上都可以遵循這四步過程，區別只在于底物的不同。目前，DDC的催化機理已研究得較為透徹。例如，在人、豬［23］和昆蟲中［24］。

2.4 多巴脫羧酶與無脊椎動物先天免疫系統

在無脊椎動物中，DDC主要參與先天性免疫應答。例如，它是黑色素合成過程中一種重要的酶。對于昆蟲而言，黑色素是殺菌的重要組成部分。除此之外，DDC也參與無脊椎動物表皮形成過程中的骨化、先天性免疫的吞噬及黑化作用［25］，并與昆蟲蛻皮過程相關［26］。

2.4.1 與表皮形成相關 表皮或者外殼在無脊椎動物先天免疫系統中十分重要，它們能夠非特異性的阻擋一些外界刺激所帶來的危害。作為免疫系統最外層的體表屏障，表皮的好壞、是否完整對病原菌的入侵直接相關。對于昆蟲這類無脊椎動物來說，DDC與表皮的形成息息相關。昆蟲表皮細胞能夠吸收血淋巴中的多巴，經DDC的催化反應后進一步轉化為DA。表皮細胞中轉化而來的DA被轉運到表皮黑色素前體微粒中，在酚氧化酶的作用下轉化為黑色素［27］。除此之外，昆蟲的蛻皮過程也有DDC的參與。蛻皮激素（Molting hormone，MH）作用于昆蟲表皮細胞后，首先刺激蛻皮時相關酶類的合成，促使蛋白受體結合到蛻皮激素，轉錄后誘導細胞內DDC的合成，從而開啟表皮的鞣化和硬化［28］。由此看出，DDC的正常運行，能促使無脊椎動物進行更好的免疫應答，從而大大提高其在惡劣環境中的生存效率。

2.4.2 與黑化反應相關 此外，有研究證明DDC主要參與無脊椎動物的黑化反應。無脊椎動物的先天性免疫應答主要依賴于血細胞，包括吞噬作用、結瘤、黑化作用等。Sideri等［29］研究表明，昆蟲的吞噬、黑化和骨化作用都可能依賴于DDC的活性。DDC是黑化作用過程中不可或缺的酶之一，它催化合成的神經遞質DA和5-HT均參與昆蟲傷口愈合、抵抗寄生蟲、表皮硬化等過程。Nappi等［30］通過一個DDC缺陷的果蠅突變體首次證明了DA氧化途徑參與黑色素的免疫反應。從化學反應的原理來說，黑色素是由連續的幾個氧化反應過程組成的，期間會產生多個中間代謝產物。其中一些由二酚衍生成的醌類物質具有細胞毒性，它們能夠抑制某些類型的DNA聚合酶的活性，對病原菌具有毒殺作用［31］。另一方面，Paskewitz等［32］將岡比亞按蚊DDC基因沉默后，發現其黑化作用明顯減少。這些現象說明，多巴脫羧酶除了可以調控黑色素的產生，在受到病原體侵染的時候，它也可以直接發揮先天免疫活性。

3 多巴胺能神經內分泌系統

有研究發現，以DA為代表的多巴胺能神經內分泌系統能夠反向調控DA等神經遞質及激素類物質的表達水平，從而達到調控免疫系統的目的。然而，無脊椎動物神經系統的結構與功能在不同種屬的動物中，差異較大。以果蠅以及飛蝗為代表的昆蟲，其神經系統主要由3部分組成，包括中樞神經系統、交感神經系統和外周神經系統。除此之外，甲殼類動物的內分泌系統則主要分為神經內分泌系統和非神經內分泌系統，神經內分泌系統與甲殼動物的生殖、發育、免疫防御等過程密切相關。其中，DDC參與了L-多巴向DA的轉變，L-五羥色氨酸向5-HT的轉變及L-色氨酸向色氨酸的轉變。盡管從分子機制來說，DDC不是上述任一神經遞質合成中的限速酶，但是其對三者翻譯前后水平均起著調控作用［33］。綜合近幾年的文獻，我們發現了DDC與DA在NEI系統中起到連接免疫系統與神經內分泌系統的作用，兩者缺一不可又協調互作，是一個完整的“團隊”?；诖耍钊胙芯慷喟桶纺苌窠泝确置谙到y，能更好地幫助人們探索無脊椎動物NEI系統。

3.1 兒茶酚胺系統

兒茶酚胺系統是已發現的一種典型的NEI系統，主要通過不同的CAs來協調機體的生長發育。從分子結構角度闡述，CAs是指含有鄰苯二酚基本結構的胺類，它包含了DA為代表的一系列生物胺能神經內分泌系統?？茖W研究表明，CAs不僅是交感和中樞神經系統中的神經遞質和神經調質，也是腎上腺髓質所分泌的激素。它能夠在生物體內起到信號傳遞的作用，影響機體的免疫應答過程。兒茶酚胺生成代謝通路是一連串的酶催化反應過程，各種各樣的酶在這之中起到主導作用。抑制某些酶的生物學活性甚至會阻斷整個通路，而DDC是一個連接上下游通路的關鍵酶，它能直觀的調控CAs的表達量。調查顯示，在某些神經內分泌細胞中，兒茶酚胺在生物體內能夠調控轉錄因子的表達（圖4）。

生物體的免疫系統十分復雜，至今為止，科學家們對免疫系統的作用機理還未探索完全。對于免疫細胞內合成的內源性CAs，已經有研究證明它在多種生物學過程中起作用。內源性CAs不僅可以調節細胞的增殖與分化，甚至可以調控細胞的凋亡過程。它的作用機制和免疫細胞上的受體相關，CAs通過自分泌或旁分泌的形式釋放到細胞中，最終結合免疫細胞上的受體，改變細胞內環磷酸腺苷（Cyclic AMP，cAMP）的濃度，以此達到免疫調節的目的。然而在無脊椎動物中，對于兒茶酚胺系統關鍵成分的研究并不多，只有少量的在果蠅、庫蚊［34］、牡蠣［35］和扇貝［36］等幾個物種中有所報道。

3.2 多巴胺

多巴脫羧酶催化生成的多巴胺（Dopamine，DA）是一種代表性的兒茶酚胺類神經遞質，它的化學式全名叫4-（2-乙胺基）苯-1，2-二酚。1910年，George Barger和James Ewens首次在英國倫敦Wellcome實驗室合成得到DA［37］。由此，科學家們展開了對DA的大量探索與研究。已有的實驗結果表明：DA的作用機制也是通過特異性結合細胞膜上受體，調節二級信使的濃度以達到調控機體的目的。多巴胺受體（Dopamine receptor，DAR）是一類具有七次跨膜結構域的GTP結合蛋白偶聯受體（G protein-coupled receptors）。1979 年，Kebabian［38］和Calne根據多巴胺受體對腺苷酸環化酶（Adenyl cyclase，AC）活性的抑制或促進作用，將多巴胺受體分為D1和D2兩種亞型。

圖4 軟體動物免疫細胞中完整的兒茶酚胺通路

其中，D1亞型的多巴胺受體主要通過與Gs蛋白偶聯結合，增強AC活性，促使二級信使環磷酸腺苷（Cyclic adenosine monophosphate，cAMP）濃度上升，調控免疫系統；而與此相反的是，D2亞型的多巴胺受體會偶聯Gαi蛋白，達到抑制AC活性的目的，下調cAMP的濃度［39］。DA與DAR之間的相互作用機制，進一步促進了對NEI系統的探索。

3.3 多巴胺及其受體在神經內分泌系統中的作用

多巴胺能神經內分泌系統的正常運行離不開DA、DAR和DDC的參與和調控。在高等動物中，DA主要在腦細胞和腎上腺細胞中合成，以行使神經遞質的功能為主。它是情緒、注意力甚至記憶力的調節器，涉及生物體對環境脅迫的長期適應過程。不同的多巴胺受體介導不同的細胞因子的分泌。如D3型受體能介導TNFα的分泌，而單獨運作的D2型受體或者D1型受體和D5型受體協同作用，可以介導IL-10的分泌［40］。其次，有研究者發現，DA也是生物體內的局部化學信使。類比其他的激素類物質，DA也可以調控生物體體內某些生物學反應過程。如在腎臟中，DA可以促進鈉和尿素的排泄［41］；在血管中，DA對去甲腎上腺素起抑制作用，并促使血管擴張［42］；在消化道中，它可以減緩腸胃的蠕動，從而達到保護腸黏膜的作用［43］?？偠灾?，DA作為一種神經遞質或局部化學信使，能夠對機體行為、心腦血管功能、內分泌及次級淋巴組織進行免疫調節。

在無脊椎動物中，DA除了有上述作用外，對細胞的吞噬功能也會產生影響，與脊椎動物相比這一點尤為顯著。竹攸汀［44］認為CpG寡脫氧核苷酸（Oligodeoxynucleotide）能通過激活PKC信號通路引起酚氧化酶（Phenoloxidase，PO）的激活，而酪氨酸激酶通路則反向調控PO激活。Wenisch等［45］發現，高劑量的DA能夠顯著抑制細胞對細菌的吞噬能力和自由基的釋放。由此可知，DA作為酪氨酸激酶通路中的組成部分，對無脊椎動物NEI系統的免疫調控發揮著重要作用。

4 展望

綜合以上的文獻調查內容，可以看出，無脊椎動物的神經內分泌免疫復合系統具有與高等脊椎動物一樣的結構基礎，其在神經信號的傳遞與免疫調控方面協同地發揮著作用，而多巴脫羧酶與多巴胺在無脊椎動物的NEI系統中是十分重要的組成部分。目前，這個看似簡單的NEI系統僅在櫛孔扇貝、鋸緣青蟹、中國明對蝦、斑節對蝦、凡納濱對蝦、長牡蠣和東亞飛蝗等幾個物種中進行了相關研究，淡水小龍蝦的神經內分泌免疫復合系統還沒有得到科研工作者的重視和研究。除此之外，多巴脫羧酶在小龍蝦NEI系統中的作用機理，沒有得到充分的探索，僅僅是做了一些基因表達與黑化反應調控方面的工作。因此，我們以淡水小龍蝦多巴脫羧酶作為研究對象，在基因克隆、重組表達、親和純化及抗體制備等研究內容的基礎上，希望深入探索多巴脫羧酶發揮先天免疫作用的分子機制。揭示DDC作為神經系統重要調節分子與免疫調節分子協同作用的雙重身份。